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半胱氨酸蛋白酶抑制剂（Cystatin protease inhibitor,CPIs）是一类能够抑制半胱氨酸内肽酶的天然蛋白酶抑制剂。广泛地存在于动植物及微生物中,在食品加工及医药等领域中拥有潜在的使用价值。本文以木瓜蛋白酶（Papain）为配基自制亲和填料（CNBr-Papain-Speharose 4B）并测试其稳定性,进而用于回收草鱼鱼糜漂洗液（Surimi wash water,SWW）中的CPIs,并对该CPIs的理化性质及生物学活性进行了较为系统的研究。该结果为探索漂洗液中CPIs高效快速回收纯化方法奠定了实验基础,同时为系统鉴定利用该方式回收的CPIs的性质提供了科学的参考方法。实验所得结果如下:首先草鱼鱼糜漂洗液CPIs经粗提取后,将粗提液经过用CNBr-Papain-Speharose 4B亲和层析回收CPIs,并结合抑制活性和反相酶谱法检测结果,确定纯化效率及比活性最高的峰III为目的峰。该峰在反相酶谱上呈现表观分子量为22kDa和20kDa的两条带。其在C18反相高效液相色谱（C18RP-HPLC）形成了两个尖锐峰Cystatin-I和Cystatin-II,分别纯化了21.57倍和12.16倍,收率分别为0.93%和0.51%。鱼糜漂洗液CPIs进TSK gel G2000 SWXL HPLC发现其各组分单一,并测定得分子量分别为22.0kDa和19.5kDa。同时,Cystatin-I和Cystatin-II均具较宽的酸碱稳定性和热稳定性范围;且均对木瓜蛋白酶（Papain）、组织蛋白酶B/L（Cathepsin B/L）均具有明显的抑制活性,均对胰凝乳蛋白酶（Chymotrpsin）有少量抑制作用,而对胰蛋白酶（Trypsin）不具有抑制活性。二者均属于竞争性抑制剂,其对Papain的抑制常数Ki分别为6.0nmol和16.25nmol。经双向电泳鉴定,Cystatin-I的分子量和等电点pI约为22kDa和8.6,Cystatin-II的为19.7kDa和8.6。通过RPLC-MS/MS质谱鉴定,这两种CPIs均含有Cystatins超级族的特征保守序列QVAAG,并结合该蛋白的性质分析,推断这两种CPIs有可能属于Cystatins（家族II）成员。制备亲和层析填料,用溴化氰（Cyperine Bromide,CNBr）活化的琼脂糖（Sepharose 4B）与木瓜蛋白酶（Papain）偶联制备CNBr-Papain-Speharose 4B,通过紫外光谱和红外光谱对其进行表征,出现明显的紫外吸收峰（280nm）及典型的酰胺峰(1672cm-1、1547cm-1、1249cm-1),从而确定了已将Papain偶联至CNBr-Sepharose 4B。利用重组鲢鱼Cystatin（家族II,20.9kDa）的吸附率为指标来筛选琼脂糖对Papain适宜的偶联密度,即CNBr-Speharose 4B和Papain最佳质量比为1:0.035（w/v）。以Cystatin吸附率为指标测定填料的热和pH稳定,发现该填料具有较好的耐热性和耐酸碱性、以及较好的二价金属耐受性和贮藏稳定性。