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目的:乳腺癌作为世界和我国范围内女性发病率居首位的恶性肿瘤,近年来发病率逐年上升,2018年,世界范围内因乳腺癌死亡的女性人数位居女性恶性肿瘤死亡人数的第一位,严重影响着女性的健康。目前以手术、化疗、放疗、内分泌治疗和靶向药物治疗为主体的综合治疗模式对于早期乳腺癌展示出了较好的疗效,有效延长总生存,但对于转移性乳腺癌尤其是三阴性乳腺癌缺少有效的治疗手段,预后差。近年来,免疫检查点抑制剂为代表的免疫治疗在肿瘤治疗领域取得令人瞩目的成绩。对于晚期三阴性乳腺癌患者,程序性死亡-配体1(PD-L1)抗体药物阿特珠单抗联合白蛋白紫杉醇组与安慰剂联合白蛋白紫杉醇组相比明显延长患者无进展生存期及总生存。而在免疫检查点抑制剂治疗过程中,树突状细胞(DC)的数目和功能与预后有密切关系。因此增加肿瘤浸润DC细胞的数量,提高DC细胞的功能是肿瘤免疫治疗的关键。欧夹竹桃苷(oleandrin)为欧夹竹桃中提取的单体化合物,是一种植物来源的强心苷类(CG)药物,近来有文献报道强心苷类药物能够在小剂量水平起到诱导肿瘤细胞凋亡、自噬,抑制迁移等,发挥抗肿瘤作用。除此之外,强心苷类药物还可以诱导肿瘤细胞发挥免疫原性细胞死亡(ICD)。Oleandrin的抑制肿瘤细胞增殖诱导细胞凋亡的直接杀伤肿瘤作用已被证实,但是否能够引起ICD及其机制尚未见报道。起始刺激因素诱导细胞发生死亡,使死亡的细胞具有免疫原性,可以进一步激活机体适应性免疫反应,则这种死亡方式称为ICD。细胞发生ICD时主要表现有:钙网蛋白(CRT)翻转至细胞膜,三磷酸腺苷(ATP)和高迁移率族蛋白B1(HMGB1)的释放,热休克蛋白70/90(HSP70/90)分泌等。以上死亡相关分子模式(DAMPs)可以吸引DC细胞富集,促进DC细胞成熟,释放相关细胞因子,进而激活机体抗肿瘤免疫反应。本研究着重阐明:1、Oleandrin是否能够诱导乳腺癌特别是三阴乳腺癌细胞系发生免疫原性细胞死亡。2、Oleandrin作用乳腺癌细胞是否促进DC细胞活化和影响多种细胞因子的分泌,并在体内观察oleandrin抑制乳腺癌的作用,检测肿瘤浸润免疫细胞数目的变化。3、对oleandrin诱导乳腺癌细胞的免疫原性细胞死亡的机制进行探讨。研究结果为oleandrin诱导乳腺癌细胞死亡提供新模式,为oleandrin在抗肿瘤领域的应用提供理论支持。研究方法:1、xCELLigence实时细胞分析仪检测细胞增殖情况。2、Annexin-V/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡。3、Hoechst33342染色荧光显微镜检测细胞核形态。4、免疫荧光法检测细胞CRT表达部位。5、ELISA法检测分泌蛋白表达水平。6、化学发光法检测释放ATP表达水平。7、细胞因子诱导法体外培养DC细胞。8、应用流式细胞仪分选DC与肿瘤细胞共培养后的DC细胞。9、流式细胞术检测细胞表面蛋白的表达。10、qRT-PCR法检测细胞mRNA表达水平的变化。11、Western blotting法检测细胞蛋白表达水平的变化。12、EMT6细胞Balb/c小鼠乳腺原位种瘤,药物干预,测量肿瘤大小变化。13、每组实验重复3次,采用SPSS 23.0统计软件进行t检验或单因素方差分析(ANOVA),结果以均数±标准差((?)±s)表示,p<0.05认为有统计学意义。结果:1、不同浓度Oleandrin作用于MCF7(Luminal A型)、SK-BR-3(HER2~+型)和MDA-MB-231(TNBC)乳腺癌细胞系,x CELLigence实时细胞分析系统显示Oleandrin对于3组乳腺癌细胞系均有杀伤作用,呈剂量/时间依赖性。而对于正常乳腺上皮细胞MCF10A无明显杀伤作用。为进一步研究可能的死亡形式,选取非三阴乳腺癌细胞系MCF7和三阴乳腺癌细胞系MDA-MB-231进行后续研究,oleandrin浓度选取24h半数致死浓度(IC50)。Annexin-V/PI双染流式细胞术结果显示oleandrin能够诱导乳腺癌细胞系发生凋亡,Hoechst33342染色观察到细胞核固缩和碎裂。2、Oleandrin诱导乳腺癌细胞发生免疫原性细胞死亡,以各组细胞24h IC50作用于MCF7和MDA-MB-231细胞系:(1)免疫荧光实验结果显示CRT由细胞质表达,变为细胞膜表达。进一步应用流式细胞术检测细胞CRT细胞膜表达的百分比,结果显示oleandrin作用细胞6h后PI~-/CRT~+细胞比例明显增加。(2)ELISA结果显示,在oleandrin处理细胞24h后,在培养上清中检测到HMGB1的释放。(3)化学发光法结果显示在oleandrin作用细胞6h后,在细胞培养体系中就检测到ATP的释放,并在12h达到峰值。(4)收集oleandrin作用后的细胞培养上清与细胞。上清浓缩,细胞提取蛋白,应用Western blotting法检测细胞与上清中HSP70/90的表达。结果显示药物作用48h后,在细胞培养上清中检测到HSP70/90的表达,细胞中两种蛋白的表达无明显变化。3、Oleandrin诱导乳腺癌细胞发生免疫原性细胞死亡激活抗肿瘤免疫反应。流式细胞术确定肿瘤细胞与健康自愿者外周血HLA表型,选择表达为HLA-A2的肿瘤细胞系MDA-MB-231与自愿者外周血进行后续实验。应用细胞因子诱导法体外培养DC细胞,与MDA-MB-231细胞共同培养,同时给予或不给予oleandrin处理,48h后流式细胞分选仪分选CD45阳性的DC细胞,对DC细胞进行qRT-PCR检测结果发现,oleandrin处理组与非处理组相比CD86、IL-2和IFN-γ的mRNA表达水平皆有明显增加,IL-10水平明显下降。进一步应用流式细胞术与ELISA法检测蛋白水平表达,结果显示CD86虽然在mRNA水平有明显增加,但在细胞表面蛋白表达百分比与oleandrin非处理组无明显差异,都已达到较高水平,CD80表达增加,HLA-DR表达无变化。细胞因子分泌结果显示IL-2和IFN-γ的分泌水平增加,IL-10分泌水平降低。在动物模型体内继续观察oleandrin对于免疫反应的影响,选取Balb/c小鼠和Balb/c小鼠来源的乳腺癌细胞系EMT6,小鼠乳腺原位种瘤,每天一次腹腔注射生理盐水、oleandrin 0.3mg/kg或0.6mg/kg。0.3mg/kg组小鼠肿瘤生长得到抑制,0.6mg/kg组小鼠肿瘤明显缩小。进一步切取肿瘤组织,提取原代细胞进行流式细胞术检测脾脏与肿瘤组织浸润的免疫细胞,结果显示oleandrin增加脾脏CD3~+CD4~+和CD3~+CD8~+T细胞百分比,DC细胞无明显变化。oleandrin能够增加肿瘤组织浸润的DC数目,同时也增加了CD3~+CD4~+和CD3~+CD8~+T细胞数目,其中以CD3~+CD8~+T细胞为主。4、Oleandrin通过内质网应激诱导乳腺癌细胞免疫原性细胞死亡,进而激活线粒体凋亡通路诱导凋亡。为进一步探讨oleandrin诱导乳腺癌细胞免疫原性细胞死亡的可能机制及与凋亡的关系,应用凋亡抑制剂z-VAD-fmk观察其对oleandrin引起的凋亡及CRT翻转的影响,结果显示z-VAD-fmk能够抑制oleandrin诱导的乳腺癌细胞凋亡,但不能抑制乳腺癌细胞CRT的翻转。进一步应用Western blotting检测,发现内质网应激通路p-PERK、eIF2α、p-e IF2α、ATF-4和CHOP表达上调,PERK表达无明显变化。线粒体凋亡通路作为CHOP下游调节凋亡的重要信号通路,检测Bcl-2家族相关蛋白表达。结果显示,oleandrin抑制Bcl-2蛋白的表达,上调Bim和Bax表达。结论:1、Oleandrin能够杀伤多种乳腺癌细胞系,诱导其凋亡和免疫原性细胞死亡有关。2、Oleandrin诱导乳腺癌细胞发生免疫原性细胞死亡,能够在体外和体内激活抗肿瘤免疫反应。3、Oleandrin通过内质网应激诱导乳腺癌细胞免疫原性细胞死亡,进而激活线粒体凋亡通路诱导凋亡。