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奶牛乳腺炎是奶牛养殖业中最常见的疾病之一。该疾病是由于乳腺机械损伤、病原菌入侵和繁殖等原因所引起的,会引起乳液的物理,化学和微生物变化,并且能引起乳腺组织的病理改变,对奶牛的生殖性能产生影响。环状RNA(circ RNA)是一类具有调控基因表达功能的分子,包含大量的mi RNA反应元件(mi RNA response elements,MRE),可作为mi RNA的“海绵”,充当竞争性内源RNA(competing endogenous RNAs,ce RNA),结合mi RNA并抑制其功能,调控下游基因的表达。基于环状RNA的相关特性,本研究室在前期运用金黄色葡萄球菌对奶牛乳腺上皮细胞(Mammary alveolar cells,MAC-T)诱导炎性应答后进行的高通量测序研究,发现了一个新型环状RNA(命名为circ0001186),其表达水平显著下调,经生物信息学分析该circ RNA可能与细胞增殖相关。以MAC-T为模型,运用RT-q PCR、细胞活力检测法(CCK-8)、细胞增殖能力检测(EDU)和双荧光素酶报告实验等方法,研究了该环状RNA对奶牛乳腺上皮细胞生物学功能的影响以及该环状RNA作为mi RNA海绵对下游靶基因功能的影响,主要研究结果如下:(1)通过前期的高通量测序,获得circ-0001186序列,circ-0001186全长874bp,由其亲本基因ZNF609的第二个外显子首尾相接环化形成,分别检测了该环状RNA在乳腺组织、心、肝、脾、肺、肾、胃、肠中的表达量,结果发现其在乳腺组织中的表达量较低;以MAC-T为模型,成功构建了过表达circ-0001186的MAC-T细胞系,使用RNase R酶消化细胞,验证circ-0001186的成环特性。运用CCK-8试验验证circ-0001186对MAC-T细胞活力的影响,结果发现,与对照组相比,过表达circ-0001186组MACT细胞活力明显增强。此外,EDU细胞增殖染色试验结果也显示,与对照组相比,过表达circ-0001186组MAC-T细胞增殖能力增强。上述结果表明,circ-0001186可以增强MAC-T细胞活力,促进细胞增殖。(2)通过生物信息学分析发现circ-0001186可与mi R-3432a结合,经序列分析确定结合位点,分别设计野生型(WT)和突变型(MUT)引物,扩增序列,将目的片段连接到psi CHECK2载体上,与mi RNA模拟物(mimic)、mimic NC共转染至293-T细胞中,运用双荧光素酶报告实验对预测结果进行验证,结果表明,circ-WT和mi R-3432a mimic共转染组的相对荧光强度明显低于其他3组,表明circ-0001186可与mi R-3432a结合。为了进一步探究mi R-3432a作为circ-0001186的“海绵”是否可以影响MAC-T细胞的功能,将mi R-3432a mimic和mi R-3432a inhibitor转染到过表达circ-0001186的MAC-T细胞中,运用CCK-8试验验证mi R-3432a对过表达circ-0001186的MAC-T细胞活性的影响,结果发现,与mi R-3432a inhibitor组相比,mi R-3432a mimic组过表达circ-0001186的MAC-T细胞活力减弱,EDU细胞增殖试验结果也显示,mi R-3432a mimic组的过表达circ-0001186的MAC-T细胞增殖能力减弱。通过生物信息学分析发现mi R-3432a可靶向调控Jun D,经序列分析确定其结合位点,构建包含有WT和MUT序列的质粒,与mi RNA mimic、mimic NC共转染293-T细胞,运用双荧光素酶报告实验进行验证,结果表明,Jun D-WT和mi R-3432a mimic共转染组的相对荧光强度明显低于其他三组,证明mi R-3432a与m RNA Jun D结合。基于以上研究结果,circ-0001186可能通过与mi R-3432a相结合调控m RNA Jun D,从而影响过表达circ-0001186所导致的MAC-T细胞功能变化。本研究通过构建过表达circ-0001186的MAC-T细胞系,对circ-0001186的生物学功能进行了研究,结果表明,过表达环状RNA circ-0001186可以影响MAC-T细胞的增殖能力和细胞活力。circ-0001186可以作为mi R-3432a的“海绵”,竞争性地结合mi R-3432a,上调其靶蛋白Jun D的表达量,减弱过表达circ-0001186所致的MAC-T细胞活力和细胞增殖能力增强的功能,使MAC-T细胞活力下降,细胞增殖得到抑制。