【摘 要】
：
目的:制备特异性Dectin-1纳米抗体并检测其在真菌性角膜炎能否发挥抗炎作用。方法:1.将辅助噬菌体M13K07侵染已经构建成功的噬菌体文库,得到从宿主菌释放出的噬菌体。经过三轮浓度为100、10、1μg/m L的Dectin-1重组蛋白淘选后,进行多克隆噬菌体间接ELISA法验证特异性噬菌体被富集。用单克隆噬菌体间接ELISA法对噬菌体特异性进行验证,淘选出携带特异性针对Dectin-1的纳米
论文部分内容阅读
目的:制备特异性Dectin-1纳米抗体并检测其在真菌性角膜炎能否发挥抗炎作用。方法:1.将辅助噬菌体M13K07侵染已经构建成功的噬菌体文库,得到从宿主菌释放出的噬菌体。经过三轮浓度为100、10、1μg/m L的Dectin-1重组蛋白淘选后,进行多克隆噬菌体间接ELISA法验证特异性噬菌体被富集。用单克隆噬菌体间接ELISA法对噬菌体特异性进行验证,淘选出携带特异性针对Dectin-1的纳米抗体的单克隆基因的噬菌体,并确定特异性最强的噬菌体及其对应的目的基因序列。2.首先,利用PCR技术将特异性Dectin-1纳米抗体的目的基因进行克隆。选取Bam H I和Not I两个酶切位点的核酸内切酶对p ET28a质粒进行酶切。用T4 DNA连接酶将目的基因与酶切后质粒进行连接。3.将构建好的质粒表达载体导入感受态细胞,加入终浓度为0.5 mmol/L IPTG后分别在37℃4 h及16℃过夜诱导表达,探索纳米抗体最佳的表达条件。4.将诱导表达完的菌体用超声细胞破碎仪进行破碎,上清与沉淀分别进行12%SDS-PAGE,验证纳米抗体的表达形式是上清表达或包涵体表达。5.利用8 M的尿素将包涵体中的纳米抗体蛋白进行变性,使其成为可溶性蛋白并从包涵体沉淀中析出。用镍离子柱对析出的可溶性蛋白进行纯化,分别用不同浓度的咪唑洗脱蛋白,确定最佳的洗脱条件。对纯化后的蛋白进行透析复性和超滤浓缩。6.利用Bradford法测定浓缩后蛋白的浓度。间接ELISA法及细胞免疫荧光分别验证特异性Dectin-1纳米抗体对Dectin-1重组蛋白和HCECs、RAW264.7巨噬细胞中表达的Dectin-1的特异性。7.建立烟曲霉菌性角膜炎的小鼠动物模型,分为溶剂对照组和纳米抗体处理组,用裂隙灯显微镜记录不同建模时间点各组小鼠角膜的情况,炎症评分评估烟曲霉菌性角膜炎的炎症反应程度。利用rt-PCR和ELISA法分别检测特异性Dectin-1纳米抗体在烟曲霉菌刺激后HCECs及小鼠角膜中对炎症因子IL-1β、IL-6的m RNA及蛋白表达水平的影响。结果:1.第一轮淘选后噬菌体OD450 nm与阴性对照相比没有明显差别,三轮淘选后OD450 nm显著上升。间接ELISA实验中共挑选到26个阳性克隆,阳性率为27%。挑取其中4个特异性较强的噬菌体再次验证,OD450 nm均高于阴性对照值的3倍。挑选与抗原特异性结合力最强的噬菌体进行PCR及核酸电泳,特异性Dectin-1纳米抗体基因条带出现在约500 bp左右。基因测序结果显示特异性Dectin-1纳米抗体的目的基因为357 bp,基因序列对应的氨基酸序列显示抗体的结构完整,NCBI比对后确认基因来源为鲨源,且匹配度较高。2.特异性Dectin-1纳米抗体最佳表达条件为加入终浓度0.5 mmol/L IPTG后16℃过夜诱导表达,且包涵体表达。利用镍离子柱对蛋白进行纯化,20 mmol/L的咪唑可以洗出蛋白中的杂质,100 mmol/L的咪唑可以完全将目的蛋白洗脱。纯化后蛋白进行透析复性并超滤浓缩后行12%SDS-PAGE,在17 k Da左右有明显单一蛋白条带。3.间接ELISA法结果表明特异性Dectin-1的纳米抗体对Dectin-1重组蛋白有较强的特异性。细胞的免疫荧光显示特异性Dectin-1纳米抗体能够与HCECs及RAW264.7巨噬细胞中表达的Decitn-1结合。4.烟曲霉菌感染后3天和5天后,与PBS对照组相比,特异性Dectin-1纳米抗体处理组小鼠角膜混浊程度减轻,溃疡面积减小,炎症评分降低;特异性Dectin-1纳米抗体处理组IL-1β、IL-6的m RNA和蛋白表达水平较PBS对照组降低。5.特异性Dectin-1纳米抗体预处理烟曲霉菌刺激的HCECs能够降低炎症因子IL-1β、IL-6 m RNA和蛋白表达水平。结论:特异性Dectin-1的纳米抗体可以通过原核生物表达系统成功表达,且表达产量高。特异性Dectin-1纳米抗体对Dectin-1抗原具有高亲和力,能够减轻真菌感染后小鼠角膜及HCECs的炎症反应程度。提示特异性Dectin-1的纳米抗体有望作为新型的抗炎成份,应用于真菌性角膜炎的治疗中。
其他文献
目的:探讨硬膜外阻滞复合自主呼吸下喉罩全麻用于小儿腹腔镜斜疝疝囊高位结扎手术的可行性与安全性,为小儿腔镜短小手术提供安全、有效、合理的麻醉方案。方法:选择2019年3月至2019年8月于我院行腹腔镜斜疝疝囊高位结扎手术的患儿40例。采用了随机的数字表方法将患儿分为对照组和观察组,对照组采用喉罩机械正压通气下全身麻醉,观察组采用硬膜外阻滞复合自主呼吸下喉罩全身麻醉,每组20例。通过比较两组患儿在麻醉
目的:由遗传、环境等多种因素引起的年龄相关性听力损失和认知功能下降是世界范围内的公共卫生挑战。已有研究显示听力损失和认知功能下降之间有共同的发病机制和遗传基础,且探讨听力和认知功能的联合遗传效应的研究较少。因此,本研究使用青岛市双生子样本开展双变量遗传分析,探讨听力和认知功能的遗传相关性,同时利用双变量全基因组关联分析寻找二者共有的遗传变异位点、基因和通路。方法:本研究选用359对青岛市双生子样本
偶氮酯类化合物最早是在天然产物和药物等生物活性大分子中发现的,随着化学水平的不断提高,它在有机合成领域成为了一类非常活跃的底物,在药物合成领域也是一类重要的药物中间体。下面我们简单介绍偶氮酯类化合物在有机化学领域中参与的化学反应。偶氮酯类化合物可以合成吲哚衍生物,构建含硫的季碳手性分子,合成具有轴手性的化合物,实现中心手性向轴手性的转化反应,作为多组分反应的一员来合成更为复杂的环骨架化合物。尽管在
目的本项研究旨在探究tRNA来源的小RNA（tRNA-derived small RNA,ts RNA）在主动脉夹层（Aortic dissection,AD）中对血管平滑肌细胞功能的调控作用及机制,为主动脉夹层的预防及治疗提供新的精准靶标。方法（1）经过文献查阅的方法,筛选到一条应激诱导RNA（tRNA-derived stress-induced RNA,tiRNA）,即5’tiRNA-Cys
目的结肠癌是世界范围内常见的造成死亡的恶性肿瘤之一。在真核生物中,N6-腺苷酸甲基化修饰（N6-methyladenosine,m6A）是最常见的可逆性mRNA修饰,在体内各种生物功能中起着至关重要的作用。m6A调控因子的异常表达和基因改变与肿瘤发生、癌细胞增殖、肿瘤微环境和肿瘤预后相关。本研究利用数据库的RNA-seq数据和结肠癌临床数据来探讨m6A甲基化与结肠癌的关系。方法利用各种R包对Gen
目的:探讨乳腺导管原位癌（Ductal Carcinoma In Situ,DCIS）不同病理学免疫组织化学分型的临床病理学表现及影像学表现,为临床个性化治疗和预后提供更多依据。方法:回顾性的分析2016年至2020年在青岛大学附属医院经临床手术病理证实的681例乳腺DCIS病灶的临床病理学资料及影像学资料。根据免疫组织化学结果将DCIS病灶分为雌激素受体（Estrogen receptor,ER
目的:1.了解FLT3-ITD基因突变阳性(FLT3-ITDmut)急性髓系白血病（acute myeloid leukemia,AML）患者临床表现及分子学特征。2.通过观察索拉非尼联合化疗一线治疗FLT3-ITDmutAML患者的诱导缓解（CR）率、总生存（OS）率、无事件生存（EFS）来评价索拉非尼治疗AML的有效性,通过观察索拉非尼治疗过程中发生的不良反应对其临床应用安全性进行分析。方法:
第一部分:垂体腺瘤出血卒中的危险因素分析目的:探讨分析垂体腺瘤出血卒中的危险因素,进一步揭示危险因素引发垂体腺瘤出血性卒中的可能机制,为垂体腺瘤出血卒中的临床预防与诊治提供策略与方向。方法:回顾性分析青岛大学附属医院神经外科2010年1月-2021年1月连续收治的875例经治无功能性垂体腺瘤患者的临床资料,其中垂体腺瘤发生出血卒中88例,未发生卒中787例。依据患者的临床表现、影像学检查、内分泌检
目的:本研究旨在探索Ⅲ期NSCLC患者行根治性同期放化疗期间,胸部三维适形放疗联合或不联合脾区低剂量照射对患者疗效和不良反应的影响,并初步探索相关机制。方法:筛选2011年7月1日至2014年7月1日在青岛大学附属医院确诊为NSCLC的ⅢA、ⅢB期（据2011年NCCN分期标准）患者,均为初诊、初治、无法行手术治疗且未行放疗,共计60例。符合入组标准的60例患者按随机数字法分为对照组（Dose2,
目的:动脉粥样硬化（atherosclerosis,AS）斑块的形成,是造成缺血性脑卒中的主要发病机制。MicroRNA-155（miR-155）能够对多种炎症相关细胞起到调节作用,进而起到影响AS形成过程的作用。NLRP3炎症小体是一种模式识别受体（PRR）,它参与了人体固有免疫过程,并在其中发挥重要作用。NLRP3炎症小体能够使下游的多种炎症因子（包括IL-1β、IL-18）被激动和活化,是A