寨卡病毒（Zika Virus，ZIKV）是一种通过伊蚊传播的单股正链RNA病毒，属黄病毒科和黄病毒属。ZIKV最初是在1947年一次黄热病研究中从乌干达寨卡森林中的恒河猴身上分离出来。虽然ZIKV在60年前就已经被发现，但是由于感染病例较少、症状较轻而没有受到重视。直到2007年雅浦岛、2013年法属波利尼西亚和2015年巴西相继暴发大规模ZIKV疫情。ZIKV感染患者常见症状为轻度发热、皮疹、结膜炎、肌肉乏力、关节疼痛以及头疼，大多数情况下症状较轻，平均症状持续时间为3-6天。早期由于尚未发现严重的并发症和出血现象，研究人员认为ZIKV感染是良性的，直到法属波利尼西亚的疫情中发现小部分患者出现神经系统并发症——吉兰巴雷综合征，以及巴西卫生部报道了孕妇ZIKV感染与胎儿小头症之间的联系，其感染的严重性开始引发广泛关注。世界卫生组织于2016年2月宣布寨卡疫情为全球紧急公共卫生事件，是继埃博拉之后的又一次全球性的重大疫情。2016 年 11 月，世卫组织宣布结束寨卡病毒的紧急状态，将控制措施调整为长期应对机制。　　E蛋白是ZIKV主要的结构蛋白和包膜糖蛋白，是病毒吸附靶细胞、侵袭致病及诱导免疫保护的关键性蛋白，在病毒的致病机理及诱发机体的抗感染免疫中发挥重要的作用，也是疫苗研究的主要候选蛋白之一。其第三结构域 EDⅢ是 E 蛋白最主要的抗原表位聚集区域，包含多种类型抗原表位，其中一些表位能够诱导产生特异性中和抗体。本研究对寨卡病毒 E 蛋白进行生物信息学分析，构建 E、E 的截短基因 sE 和EDⅢ的原核表达载体，分别克隆表达了重组E蛋白、sE蛋白和EDⅢ蛋白。通过动物免疫和细胞融合技术制备抗sE和EDⅢ蛋白的多克隆抗体和单克隆抗体，并对抗体的效价和特异性进行了初步鉴定，克隆和分析了单克隆抗体的可变区编码基因。　　本研究使用 BLAST、Protparam、PredictProtein、DNASTAR、SWISS-MODEL、ABCPred等工具对E蛋白理化性质、结构、跨膜域以及抗原表位等进行生物信息学分析，与其他黄病毒属病毒的E蛋白进行多序列比对和系统进化分析。根据E和EDⅢ基因的cDNA序列设计引物，PCR扩增出目的基因，分别连接到pET32a（Kana+）和pET28a（Amp+）质粒，构建原核表达载体pET32a/E和pET28a/EDⅢ。为提高蛋白表达和纯化效率，对E基因序列进行改造，根据预测结果剔除其难以表达的跨膜区域序列，对密码子偏嗜性进行优化，通过全基因合成的方法获得优化后的片段sE并构建表达载体pET32a/sE。将三个重组载体分别转入大肠杆菌BL21（DE3）感受态，使用IPTG诱导蛋白表达，超声破碎后经SDS-PAGE电泳分析蛋白可溶性。使用Ni-NTA亲和层析法纯化表达的重组蛋白。用纯化的重组sE蛋白和EDⅢ蛋白分别免疫新西兰白兔，分离血清得到兔源sE和EDⅢ多克隆抗体。间接酶联免疫吸附试验（间接ELISA）检测多克隆抗体效价，蛋白免疫印迹实验（Western Blot）鉴定多克隆抗体的特异性，使用辛酸-硫酸铵法纯化多克隆抗体。同时，以重组sE和EDⅢ蛋白分别免疫BALB/c小鼠，用常规方法在融合剂PEG1450（50%）的作用下使小鼠B淋巴细胞与SP2/0细胞融合，间接ELISA和有限稀释法筛选分泌抗sE蛋白和EDⅢ的杂交瘤细胞。无菌石蜡油注射小鼠腹腔，10 d后扩大培养的单克隆抗体杂交瘤细胞株注射至小鼠腹腔，诱导腹水，7~10 d后收集腹水，辛酸-硫酸铵法纯化后获得腹水型单克隆抗体。采用抗体亚类鉴定试剂盒鉴定单克隆抗体的亚型，间接ELISA测定腹水效价，Western Blot鉴定单克隆抗体的特异性。收集EDⅢ单克隆抗体杂交瘤细胞提取总RNA，反转录为cDNA，根据单抗亚型设计鼠单克隆抗体重链和轻链的简并引物，PCR法扩增获得单抗可变区基因VH和VL，扩增产物分别克隆至pEASY-T1载体，筛选阳性转化子进行测序，使用BLAST、IgBLAST等工具对测序结果进行分析。　　生物信息学分析结果显示，E 蛋白亲水性、可及性和可塑性良好，预测到大量 B细胞抗原表位，提示有两个跨膜区域，且跨膜域内均未预测到抗原表位，剔除跨膜域后的截短蛋白预测结构未见改变。经测序验证获得重组表达载体 pET32a/sE 和pET28a/EDⅢ，转化原核细胞诱导表达，纯化获得纯度约90%的重组sE蛋白和EDⅢ蛋白。免疫制备兔源sE多克隆抗体的效价为1:819 200，EDⅢ多克隆抗体效价为1:819 200，Western blot结果显示二者均具有较好的特异性。运用单克隆抗体技术筛选得到2株抗sE杂交瘤细胞（分别命名为2D11和7B5）和1株抗EDⅢ杂交瘤细胞（命名为4B4），3株单抗细胞均能够稳定分泌单克隆抗体。亚型鉴定试剂盒鉴定显示，两株抗sE单抗亚型均为IgM/κ，其中效价较高的7B5制备的腹水效价达到1:2 560，抗EDⅢ单抗亚型为IgG2a/κ，制备的小鼠腹水效价达到1:5 120。成功克隆得到抗EDⅢ单克隆抗体4B4重链和轻链可变区基因，测序结果证实序列与单抗亚型的特征一致。　　本研究成功构建原核表达载体pET32a/sE和pET28a/EDⅢ，纯化获得纯度和浓度都较高的sE和EDⅢ蛋白，以重组蛋白为抗原制备获得两种兔源多克隆抗体和3株单克隆抗体。克隆和分析了抗 EDⅢ单克隆抗体 4B4 重链和轻链可变区基因。本研究结果为后续ZIKV感染免疫学快速检测和亚单位疫苗的研发提供了有力的工具，为构建相关基因工程抗体奠定了基础。