甘薯IbLCYB2、IbARF5和IbbZIP1基因的克隆和功能鉴定

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本研究以甘薯品系HVB-3为材料,利用RACE技术克隆得到编码番茄红素β-环化酶的基因IbLCYB2、生长素响应因子(ARF family)基因IbARF5和碱性亮氨酸拉链类转录因子(bZIP family)基因IbbZIP1。将IbLCYB2基因导入甘薯品种商薯19,分别将IbARF5和IbbZIP1这两个基因导入模式植物拟南芥中,获得了转基因植株,并对其功能进行了鉴定。主要结果如下:1.IbLCYB2基因的cDNA全长为2343 bp,ORF为1506 bp,编码501个aa。该蛋白质的分子量为56.46 kDa,等电点为8.02。IbLCYB2基因具有1个外显子,没有内含子。该基因在甘薯叶片中表达量显著地高于块根和茎,且被NaCl、PEG和ABA诱导表达。亚细胞定位实验表明IbLCYB2基因编码一个叶绿体定位蛋白。进一步研究发现IbLCYB2基因在商薯19中的过表达显著提高转基因甘薯块根中α-胡萝卜素、叶黄素、β-胡萝卜素、β-隐黄质和玉米黄质的含量。分析表明,过表达IbLCYB2基因上调类胡萝卜素合成途径中相关基因的表达,从而显著提高了转基因植株块根中的类胡萝卜素含量。同时,过表达IbLCYB2基因的转基因植株的耐盐性、抗旱性和抗氧化性得到显著提高,在高盐、干旱和氧化胁迫下,转基因植株中ABA含量、脯氨酸含量以及SOD活性显著提高,而MDA和H2O2的积累量则显著降低,ABA合成途径、脯氨酸合成途径以及活性氧清除系统相关基因显著上调表达,明确了该基因提高甘薯耐盐性、抗旱性和抗氧化的分子机理。因此,IbLCYB2基因可应用于改良甘薯的类胡萝卜素含量以及非生物胁迫抗性。2.用RACE方法克隆得到IbARF5,其cDNA全长为3757 bp,ORF为2841 bp,编码946个aa,该蛋白质分子量为104.84 kDa,等电点为5.17;基因组全长为4794 bp,具有13个外显子和12个内含子。该基因在甘薯块根中表达量最高,同时,受到NaCl、PEG和ABA的诱导表达。亚细胞定位结果表明IbARF5蛋白定位于细胞核上。转录自激活实验证明IbARF5基因具有转录激活活性,并且转录激活活性区域位于编码序列的中间部分。在拟南芥中过表达IbARF5基因显著提高转基因拟南芥叶片和种子中的类胡萝卜素含量,提高了叶片的叶黄素、玉米黄质和总类胡萝卜素含量,提高了种子的叶黄素、β-胡萝卜素、玉米黄质和总类胡萝卜素含量。qRT-PCR分析表明,类胡萝卜素合成相关基因在转基因植株的叶片和种子中有不同程度的上调表达,从而导致过表达植株叶片和种子中的类胡萝卜素含量提高。除此之外转基因拟南芥的耐盐性和抗旱性也显著增强。在NaCl和自然干旱的胁迫下,转基因拟南芥植株体内的ABA含量、脯氨酸含量和SOD活性显著高于野生型植株,H2O2的含量显著低于野生型植株;ABA合成途径、脯氨酸合成途径和ROS清除系统相关基因显著上调表达,从而显著提高了转基因拟南芥植株的耐盐性和抗旱性。本研究首次明确该基因的过表达能够提高转基因植物的类胡萝卜素含量,并且增强转基因植株的耐盐性和抗旱性,研究结果为甘薯和其他植物品质和耐盐抗旱性改良提供了新的基因。3.通过RACE方法克隆得到IbbZIP1,其cDNA全长为1757 bp,ORF为1080 bp,编码359个aa,该蛋白质分子量为41.26 kDa,等电点为7.89;基因组全长1946 bp,具有4个外显子和3个内含子,启动子长度为2056 bp。IbbZIP1基因在甘薯叶片中表达量最高,且受到NaCl、PEG和ABA的诱导表达。在拟南芥中过表达IbbZIP1基因显著提高转基因拟南芥的耐盐性和抗旱性。在NaCl和自然干旱的胁迫下,转基因拟南芥植株体内的ABA含量、脯氨酸含量和SOD活性显著高于野生型植株,H2O2的含量显著低于野生型植株;ABA合成途径、脯氨酸合成途径和ROS清除系统相关基因显著上调表达,从而显著提高了转基因拟南芥植株的耐盐性和抗旱性。本研究首次明确该基因的过表达能够增强植株的耐盐性和抗旱性,研究结果为甘薯和其他植物品质和耐盐抗旱性改良提供了新的基因。
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