论文部分内容阅读
目的： 以达那唑诱导的雌性性早熟大鼠模型为研究对象,观察性早熟大鼠青春期发育过程中下丘脑NKB及其受体NK3R的表达规律,以探讨NKB/NK3R通路在性早熟大鼠青春期发育中的作用；给予性早熟模型大鼠滋阴泻火中药合剂进行治疗,观察滋阴泻火中药合剂对性早熟大鼠下丘脑NKB和NK3R表达的影响,以进一步揭示滋阴泻火中药合剂治疗性早熟的作用机制。方法： (1)将SD大鼠随机分为正常组(N)、模型组(M)、生理盐水组(MS)和中药组(TCM),M、MS、TCM组大鼠在出生后第五天给予皮下注射达那唑3001μg(溶于250μ1乙醇乙二醇等体积溶液),N组不做任何处理；从出生后第15天开始,TCM组给予滋阴泻火中药合剂(生药量3.3g/ml,1.29ml/100g体重)灌胃,MS组给予等量生理盐水,至取材时为止。(2)大鼠从出生后20天开始,每天观察阴门开启情况,阴门开启后每天做阴道涂片观察大鼠动情周期变化,至取材为止。(3)取材分三个时间点,青春期启动前(21天断奶时),青春期启动时(阴门开启时),青春期启动后(建立两个规律性周期,即第二个动情间期),以模型组为标准同时选取相应数量的其他三组一并取材。用4%多聚甲醛心脏灌流取脑或直接断头法,留取大鼠外周血、下丘脑、子宫、卵巢等标本,子宫、卵巢称重计算器官系数。(4)放免法检测外周血血清中E2、FSH、LH、T的水平(5)HE染色观察大鼠子宫、卵巢发育情况(6)应用免疫组化ABC法及免疫荧光法观察大鼠下丘脑NKB及NK3R的表达情况(7)采用Real-time PCR法检测大鼠下丘脑NKB及NK3R mRNA的表达变化。(8)采用western-blot观察下丘脑NK3R的蛋白表达情况。结果：(1)模型组大鼠阴门开启及建立两个规律性周期的时间明显早于正常组,给予滋阴泻火中药后可明显延迟其阴门开启及建立两个规律性周期的时间。(2)青春期启动时模型组动物血清中E2、FSH和T的水平升高,与正常组相比(P<0.05)；而中药组与模型组相比,血清中E2, FSH水平明显降低(P<0.05)。(3)青春期启动前各组大鼠子宫和卵巢的器官系数无明显差异；青春期启动时模型组大鼠子宫和卵巢的器官系数明显高于正常组(P<0.05),中药组与模型组相比器官系数显著降低(P<0.05)；青春期启动后,也表现相似趋势,表现为中药组与模型组相比子宫和卵巢器官系数显著降低(P<0.05)。HE染色发现,青春期启动时,模型组大鼠子宫壁厚度以及成熟卵泡的数量明显高于正常组,而给予滋阴泻火中药合剂后明显降低了子宫壁的厚度及成熟卵泡的数量。(4)青春期启动前,各组大鼠下丘脑ARC和MPO的NKB及NK3R表达无明显差异；青春其启动时,各组大鼠下丘脑ARC和MP0的NKB、NK3R表达与青春期前相比都有所上升；模型组明显高于正常组(P<0.05)；与模型组相比,中药组下丘脑ARC和MPO的NKB、NK3R表达明显下调(P<0.05)。青春期启动后,在ARC,模型组NKB与NK3R的表达高于正常组(P<0.05)；与模型组相比,中药组大鼠下丘脑ARC的NKB.NK3R表达明显下调(P<0.05)；在MPO,模型组NKB的表达要低于正常组(P<0.05),与模型组相比,中药组上调了NKB的表达；MP0区NK3R的表达变化与青春期启动时基本一致,模型组高于正常组(P<0.05),与模型组相比,中药组表达下调(P<0.05)。(5)青春期启动时,与正常组相比,模型组大鼠下丘脑NKB及NK3R mRNA的表达显著上升(P<0.01),给予滋阴泻火中药合剂后,中药组大鼠下丘脑NI(B(P<0.01)及NK3R(P<0.05) mRNA的表达明显降低。(6)青春期启动时,与正常组相比,模型组大鼠下丘脑NK3R蛋白的表达明显升高(P<0.05),与模型组相比,中药组大鼠下丘脑NK3R蛋白的表达明显下调(P<0.05)。结论：滋阴泻火中药合剂对性早熟有明显的治疗作用：滋阴泻火中药合剂可显著改善雌性性早熟大鼠的症状。雌性性早熟大鼠模型青春期启动时,其下丘脑NKB及其受体NK3R的表达明显高于正常组,提示NKB/NK3R通路可能参与了青春期启动过程。给予大鼠滋阴泻火中药合剂后,下丘脑NKB和NK3R mRNA和蛋白的表达明显下调,从而影响了下丘脑GnRH的分泌,进而抑制HPGA功能,延缓青春期启动,这可能是滋阴泻火中药发挥治疗性早熟作用的又一重要途径。