蚯蚓金属硫蛋白基因对烟草的遗传转化研究

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金属硫蛋白(Metallothionein 简写为MT)是一种低分子量,富含半胱氨酸,并能结合重金属的蛋白质。这种存在于大多数生物体内的蛋白,其结构在进化中相当保守,功能也基本一致。研究表明,它与细胞抗重金属中毒作用密切相关。   目前,哺乳动物MT 转入植物的实例较多,尚未见无脊椎动物MT基因转化植物的报道。蚯蚓富含MT等重金属结合蛋白,能够选择性吸收并富集土壤中的镉。本研究首先通过PCR 将赤子爱胜蚓(Eisenia foetida)MT基因两端加上适当的酶切位点,以构建于植物表达载体pPZP111,得到pPZP-efMT,并经PCR和酶切实验进行确认;随后,用三亲交配法分别将其导入根瘤农杆菌EHA105和LBA4404中,质粒提取、酶切和PCR结果表明,表达载体已经转入农杆菌中;最后,通过农杆菌介导的叶盘法转化烟草。通过试验得出以下结论:经过预培养比未经预培养的外植体更易于转化;侵染过程确定最适农杆菌侵染浓度为OD600=0.6,时间为7 min;选择培养时子叶与培养基要充分接触,较容易分化。从而建立了一套适合本实验室的农杆菌转化体系。以幼苗的叶片基因组DNA为模板,PCR 扩增,经过三次重复试验,32株再生烟草幼苗,筛选出7株阳性株,初步确认efMT基因已整合到烟草基因组,为进一步验证转基因烟草的抗重金属能力奠定了基础。
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