青杄(Picea wilsonii Mast.)是我国特有的针叶树种,被广泛用于造林和园林绿化,青杄耐荫喜湿,抗寒性较强,具备优质的抗寒基因资源。然而,其耐旱能力却相对较弱,随着全球气候变暖和干旱胁迫的频繁发生,青杄的生长范围在进一步缩小,但是青杄在应对干旱胁迫时的潜在分子机制尚不清楚。NAC转录因子是植物特有的转录因子家族之一,被广泛报道参与了植物的多种生命活动,尤其是在植物应对非生物胁迫的过程中发挥了重要的作用。通过分子生物学手段研究青杄NAC转录因子的功能及相关调控机制,对提高青杄的耐旱性具有重要意义。本实验室前期通过转录组数据筛选克隆了两个响应干旱的NAC转录因子PwNAC30和PwNAC31,并初步研究了这两个转录因子在转录水平对非生物胁迫的响应。在本研究中,进一步分析了这两个基因的特性,并通过将目的基因转化拟南芥,研究了这两个NAC转录因子的生物学功能,获得的具体结果有:1、烟草亚细胞定位实验显示,PwNAC30和PwNAC31均定位于细胞核中。2、PwNAC30启动子瞬时转化烟草并进行GUS染色结果显示,PwNAC30的启动子对脱落酸(ABA)、赤霉素(GA)、茉莉酸甲酯(Me JA)、干旱、冷、盐胁迫均有明显响应,双荧光素酶报告基因实验(Luc)进一步定量证实了这个结果。将PwNAC30的启动子稳定转化拟南芥后,发现其表达存在明显的组织特异性,PwNAC30启动子主要表达在拟南芥的雌蕊中,在花瓣和雄蕊中均无明显表达。3、酵母自激活活性结果显示,PwNAC30的N端和全长不具备转录激活活性,而C端具有转录激活活性,PwNAC30能自身形成同源二聚体;PwNAC31的C端和全长均具备转录激活活性,而N端不具备转录激活活性,PwNAC31不能自身形成同源二聚体。4、通过转化模式植物拟南芥,研究了PwNAC30的生物学功能。结果显示,过表达PwNAC30显著抑制了植物对于干旱胁迫和盐胁迫的耐受性,无论是在幼苗期还是成苗期,过表达植株的耐旱能力和耐盐能力都明显低于野生型植株。通过测量不同株系在干旱和盐胁迫下的超氧化物歧化酶(SOD),过氧化物酶(POD),过氧化氢酶(CAT)和丙二醛(MDA)含量,以及通过q RT-PCR测定不同株系在非生物胁迫处理后胁迫相关基因的表达变化情况,揭示了PwNAC30通过促进活性氧(ROS)的积累和抑制胁迫相关基因的表达来削弱植物的耐旱能力。此外,过表达PwNAC30不会影响植物的花期和果荚的生长。5、通过将PwNAC31转化到其拟南芥同源基因(At NAC72)的突变体中,获得异源恢复株系。通过干旱和盐处理异源恢复株系、野生型和突变体株系,结果显示,过表达PwNAC31能够明显恢复突变体株系的耐旱和抗盐能力,最终,异源恢复株系的抗旱和抗盐能力与野生型相似,均强于突变体株系。