糖酵解和三羧酸循环（TCA循环）是生命体核心代谢途径,涉及丙酮酸（Pyr）、草酰乙酸（OAA）和2-酮基戊二酸（2-KG）三种2-酮基羧酸。前述2-酮基羧酸在生理状态下可经某些还原酶的作用,转变为相应的2-轻基羧酸:乳酸、苹果酸和2-轻基戊二酸（2-HG）。其中苹果酸为TCA循环关键中间代谢产物,乳酸和2-HG的合成分解代谢经代谢组学等手段也已被证实广泛存在于动物、植物以及微生物中。乳酸的合成分解代谢机制及其生理意义在多个生物类群中已有较为详尽的阐释,而关于2-HG的相关研究相对较少。近年来有研究发现D-2-HG的积累常伴随多种癌症发生,其被认为是一种促进癌症发生的毒性代谢物。本论文目标在于通过对D-2-HG的合成与分解机制研究,阐释D-2-HG这一毒性代谢物在胞内产生的生理意义,为深入揭示D-2-HG代谢相关疾病的发生过程提供有益借鉴。已有文献报道动物、植物通过D-2-羟基戊二酸脱氢酶（D2HGDH）实现D-2-HG的分解代谢,本论文首先通过生物信息学手段分析D2HGDH在微生物中的分布及进化关系,发现D2HGDH同源序列广泛存在于酵母等真菌及多种细菌中。然后以施氏假单胞菌（Pseudomonasstutzeri）A1501为研究对象,外源表达并分离纯化了该菌株来源的假定D2HGDH同源蛋白,体外实验表明该蛋白具有催化D-2-HG和D-苹果酸脱氢的生物学活性,催化D-2-HG脱氢产物为2-KG。首次实现了微生物来源D2HGDH的酶学性质研究,证实D2HGDH分子量104.1 KDa,为一同型二聚体,每个亚基结合1个FAD分子作为辅因子;对D-2-HG的K_m值为 0.17 mM,Vmax值为 4.56 U·mg^-1,Kcat/K_m为 2723.55 min^-1 mM^-1;确定了pH、温度、金属离子对D2HGDH酶活力的影响。活性染色结果表明,P.stutzeeri A1501中D2HGDH在不同培养基中及不同生长时期均表达;利用建立的细胞内D-2-HG的提取及检测方法,确定在不同生长时期P.stutzeri A1501胞内D-2-HG浓度均维持在20～60 μM之间;以上结果暗示该菌株中D-2-HG的产生及分解持续发生,导致D-2-HG浓度处于相对稳定状态。为进一步验证D2HGDH的体内功能,构建了P.stutzeri A1501（WT）中D2HGDH编码基因d2hgdh的敲除菌株P.stutzeri WT（△hg）与回补菌株P.stuteri WT（△dhg:dhg+）。以D-2-HG为唯一碳源培养各菌株,证实d2hgdh基因在P.stutzeri A1501同化利用D-2-HG过程中起关键作用。以葡萄糖为唯一碳源培养各菌株,表明d2hgdh敲除可造成胞内D-2-HG浓度约100倍的升高,回补d2hgdh可使胞内D-2-HG浓度恢复正常水平。另外以多种不同碳源培养各菌株时,均可观察到P.stutzeri WT（△hg）菌株生长速率变慢及最大生物量减小的现象,同时检测到在培养基中D-2-HG的大量积累（可达2800 μM）。推测d2hgdh敲除可造成P.stutzeri WT（△dhg）中代谢过程中产生的D-2-HG不能被同化利用,D-2-HG不能直接参与细胞代谢。D-2-HG的积累减少了菌体可利用的碳源量,降低了菌体利用碳源的速率,从而影响了P.stutzeri WT（△hg）的生长。而在P.stutzeri A1501（WT）与回补菌株P.stutzeri WT（△dh:dhg+）中,D-2-HG分解代谢正常存在且在细胞代谢中处于重要地位,可以将细胞代谢过程中大量产生的D-2-HG继续转变为可被利用的2-KG,实现物质和能量的充分利用。D2HGDH为非膜结合黄素依赖型脱氢酶,不能直接传递电子给呼吸链,然而D-2-HG分解代谢意味着D-2-HG脱氢导致的电子持续产生,必须伴随着D2HGDH黄素获得电子的有效传递。本论文外源表达并分离纯化了P.stutzeri A1501来源的电子转移黄素蛋白（ETF）,体外实验证实其可介导D2HGDH与人工电子受体2,6-二氯酚靛酚（DCIP）的电子传递,加速D2HGDH催化反应进行。D2HGDH 对 ETF 的K_m值为 7.71 μM,Vma为 7.50 U mg^-1,Kcat/K_m 为（1.03 ± 0.11）×10× min^-1 mM^-1。另外ETF的存在可使D2HGDH对D-2-HG的Vmax值大大增加（对其K_m值影响较小）,暗示ETF可能为D2HGDH的胞内自然电子受体。为进一步验证ETF的体内电子传递功能,构建了 ETF编码基因etf的敲除菌株P.stutzeri WT（△et）和回补菌株P.stutzeri WT（△etf:etf+）。体内实验表明etf基因对于菌体同化利用D-2-HG及维持胞内D-2-HG处于稳态起重要作用,同时ETF缺失菌株P.stutzeri WT（△etf）同样会在培养基中大量积累D-2-HG。以上体内和体外实验结果相结合,证实ETF同样在P.stutzeri A1501的D-2-HG分解代谢中起关键作用,推测其功能如下:ETF是D2HGDH的体内自然电子受体,通过与D2HGDH的耦合,构成高效的D-2-HG分解代谢系统。如前所述,P.stutzeri A1501中D-2-HG分解代谢和合成代谢在生理条件下处于平衡,胞内D-2-HG浓度维持相对恒定的水平。P.stutzeri A1501中持续的D-2-HG分解代谢意味着胞内D-2-HG必然处于持续产生的状态。通过对多种微生物中D2HGDH相邻蛋白的比较基因组学分析,发现在包括P.stutzeri A1501在内的多种微生物中D2HGDH与D-3-磷酸甘油酸脱氢酶（SerA）在基因组上相邻排列,暗示SerA和D2HGDH具有功能相关性。外源表达并分离纯化P.stutzeri A1501中SerA,证明其可以NADH为辅酶,立体特异性还原2-KG生成D-2-HG;在P.stutzeri WT（△dhg）菌株中敲除SerA编码基因serA,构建获得的d2hgdh和serA双敲除菌株P.stutzeriWT（△dhg△serA）胞内不再过量积累D-2-HG;以上体内和体外实验结果相结合可证明SerA是P.stutzeri A1501中D-2-HG合成的关键酶。SerA催化L-丝氨酸合成的第一步反应:糖酵解中间产物D-3-磷酸甘油酸（D-3-PG）氧化生成3-磷酸羟基丙酮酸（3-PHP）。SerA和D2HGDH的功能相关性暗示D-2-HG产生的生理功能可能与L-丝氨酸的合成相关。对SerA研究表明,D-3-PG氧化生成3-PHP的反应很难自发进行,而SerA催化的2-KG还原为D-2-HG的反应相对易于进行,且在SerA反应体系中添加2-KG,可有效地增强D-3-PG氧化反应。D-2-HG的生成可耦合促进D-3-PG的氧化反应,一方面是由于2-KG还原伴随NADH的氧化,可有效防止SerA和NADH形成紧密复合物,有利于SerA催化的D-3-PG与NAD间反应;另一方面D-2-HG生成与D-3-PG氧化相耦合,可有效降低SerA催化反应自由能。对SerA研究同时表明,D-2-HG对SerA催化的2-KG还原和D-3-PG氧化反应会产生明显抑制作用,可能是SerA的变构抑制剂。D-2-HG分解代谢的生理功能在于:将不能被直接利用的D-2-HG转变为可被直接利用的2-KG,后者进入细胞代谢实现物质和能量的再生,同时使胞内D-2-HG维持在较低浓度,以防止D-2-HG对SerA的抑制作用。总体而言,D2HGDH、ETF及SerA相互配合,偶联构成了一个D-2-HG合成与分解代谢模块,其生理意义在于保证SerA催化D-3-PG氧化反应的连续高效进行。D-3-PG是连接糖酵解与L-丝氨酸合成途径的关键节点,实验证实,大量糖酵解碳流耦合TCA循环中间物2-KG经过D-2-HG代谢模块进入L-丝氨酸合成途径。D-2-HG的高代谢通量表明其不应该被视为一种代谢废物,而应该被认为是一种重要的初级代谢产物。后续比较基因组学与进化分析表明D2HGDH、ETF及SerA构成的D-2-HG代谢模块在不同类群的生物体中广泛存在,在连接TCA循环、糖酵解和氨基酸合成等核心代谢途径中发挥重要作用。本论文另一部分工作涉及2-酮基丁酸（2-Oxobutyric acid,2-OBA）的生物催化法生产。2-OBA是重要的有机合成和药物合成中间体,L-苏氨酸脱氨酶（L-threonine dehydratase,L-TD）可催化 L-苏氨酸（L-Thr）脱水脱氨生成 2-OBA。考虑到L-Thr可以通过微生物发酵大规模获得,非常适合作为2-酮基丁酸生产的起始底物,本论文筛选得到含较高的合成型L-TD活力的P.stutzeri SDM,以其完整细胞作为生物催化剂,建立了以L-Thr为底物高效生物催化生产2-OBA的体系。优化后的最适催化条件为:pH 8.0;反应温度50℃;生物催化剂浓度为9.2 g DCW l^-1;底物L-苏氨酸浓度为30 g l^-1。在最适条件下,经6 h催化,2-OBA浓度可达25.6 gl^-1,底物转化率为99.6%,生产效率为41.8 mMh^-1,为目前生物法生产2-OBA的最高水平。另外2-轻基丁酸（2-HBA）可经脱氢反应生成2-OBA,也可以用来合成异亮氨酸和某些药物,同样是一种重要的工业中间体,然而,2-HBA不易获得且生成成本较高。本论文建立了利用氧化葡萄糖杆菌（Gluconobacter oxydans）DSM 2003,以廉价底物1,2-丁二醇（1,2-BDO）为底物生产D-2-羟基丁酸（D-2-HBA）的方法。以湿重60 g l^-1的完整细胞为催化剂,40 g l^-1的外消旋1,2-BDO为底物,在pH 6-7,反应温度37℃的条件下,经过21 h的转化,可产生19.7 g l^-1的D-2-HBA,对映体过量值达到99%以上。