鱼类品种繁多,亲缘距离大,在鱼类免疫球蛋白检测方面尚无通用的试剂。为了制备出广识别谱的鱼类免疫球蛋白检测试剂,采用20株针对鳜、大黄鱼、石斑鱼、鳗鲡等鱼类血清免疫球蛋白的单克隆抗体,对大黄鱼、青石斑鱼、斜带髭鲷、美国红鱼、褐菖鮋、鳜、加州鲈等26种常见经济鱼类的血清免疫球蛋白进行了系统的分析,试图筛选出广识别谱的单克隆抗体或单克隆抗体组合。一、鱼类的血清采集及其血清总蛋白分析。通过尾静脉窦采集了大黄鱼、青石斑鱼、斜带髭鲷、美国红鱼、褐菖触、鳜、加州鲈等26种常见经济鱼类的血清；通过Bradford方法测定血清总蛋白浓度。结果表明：这26种鱼类血清总蛋白浓度在9.00mg·ml-1～50 mg·ml-1之间,同种鱼不同个体之间血清蛋白总浓度的标准偏差都在1.90以上,存在明显差异；不同科目之间鱼血清蛋白浓度之间也存在很大的差异。二、免疫球蛋白的提取及其纯度与活性的分析。分别采用优球蛋白法与饱和硫酸铵分步盐析法纯化各种供试鱼类的血清免疫球蛋白,分别应用SDS-PAGE、ELISA、Western-blot等方法分析提取物的纯度和活性。实验结果证实优球蛋白法的提取效果显然优于饱和硫酸铵分步盐析法；以欧洲鳗鲡血清免疫球蛋白的提取结果为例：优球蛋白法纯化的欧鳗血清免疫球蛋白仅出现清晰的重轻链两个条带,纯度高于饱和硫酸铵提取的免疫球蛋白,ELISA和Western-blot结果也证实优球蛋白法纯化的免疫球蛋白活性高于饱和硫酸铵提纯的免疫球蛋白。结果提示优球蛋白法可以作为一种提取鱼类血清Ig的方法,且具有快速、简单、高效的特点。三、鱼类血清Ig共同抗原表位分析。选用20株针对鳜、大黄鱼、石斑鱼、鳗鲡血清免疫球蛋白的单克隆抗体,与26种常见经济鱼类血清免疫球蛋白进行交叉反应,从中筛选出广识别谱的单克隆抗体。ELISA分析结果显示：20种鳜、大黄鱼、石斑鱼、鳗鲡等鱼类血清免疫球蛋白的单克隆抗体对大黄鱼、青石斑鱼、斜带髭鲷、美国红鱼、褐菖触、鳜、加州鲈等26种经济鱼类血清免疫球蛋白交叉反应存在差异。构建了这些单克隆抗体与26种经济鱼类血清免疫球蛋白反应交叉谱。其中单抗2H5F4识别谱最广,能够识别大黄鱼、鳜鱼、加州鲈鱼、卵形鲳鲹、尼罗罗非鱼、花鲈、红罗非、青石斑鱼、斜带髭鲷、美国红鱼、黑鲷、鲤鱼、黑脊倒刺鲃、平胸鲂、白鲫鱼、大菱鲆、褐菖触18种供试鱼的血清免疫球蛋白；欧鳗Ig单克隆抗体7E2可以与欧洲鳗鲡、鳜鱼、鲤鱼、翘嘴红鲌、平胸鲂、白鲫鱼、海鳗、斑点叉尾鯝、黄颡鱼、革胡子鲶、鲶鱼发生交叉反应,将单抗2H5F4与单抗7E2等比例混合后能够与所采集的除牙鲆外的25种鱼类血清免疫球蛋白发生反应。这两种单抗可以作为制备鱼类免疫球蛋白广谱检测试剂的优良备选抗体。四、免疫球蛋白抗原位点及其反应特性分析。利用筛选到的广谱型单克隆抗体7F12F6、2H5F4对多种鱼类血清Ig的共同抗原表位进行了初步研究。其中单抗7F12F6可以识别同为鲈形目的鳜鱼、加州鲈鱼、花鲈、大黄鱼、美国红鱼、黑鲷六种鱼的轻链,表明这六种鱼的血清工g具有相同或相似的抗原表位。单抗2H5F4识别鱼类免疫球蛋白的重链,在变性还原条件下的蛋白印迹显示该单抗仅与大黄鱼、青石斑鱼、斜带髭鲷、美国红鱼、褐菖触等五种鱼免疫球蛋白的重链发生反应,在非变性非还原条件还能识别鳜、加州鲈鱼、卵形鲳鲹、尼罗罗非鱼、花鲈、红罗非鱼、美国红鱼、黑鲷、大菱鲆、鲤鱼、黑脊倒刺鲃、平胸鲂、白鲫鱼、褐菖触等另外13种供试鱼的免疫球蛋白。上述研究结果提示：不同鱼类免疫球蛋白之间存在共同抗原位点,单抗2H5F4所识别的抗原位点在大黄鱼、青石斑鱼、斜带髭鲷、美国红鱼、褐菖触等5种鱼中表现为非结构依赖性位点,其反应特性不受变性剂的影响,而在其余13种鱼中则表现为结构依赖性位点,且在变性条件下失去反应活性。五、单克隆抗体反应特异性验证。应用单抗2H5F4测定免疫与非免疫尼罗罗非鱼、鲤鱼血清特异性抗体水平,免疫组与非免疫组尼罗罗非鱼特异性抗体水平OD490为0.821、0.018；免疫组与非免疫组鲤鱼特异性抗体水平OD490为0.282、0.070。试验结果表明免疫组检测到了较高的抗体水平,该单抗可以应用于尼罗罗非鱼、鲤鱼的免疫检测当中。针对多种鱼类血清Ig的广谱型单克隆抗体的筛选与分析,开发广识别谱的鱼类免疫球蛋白检测试剂,将对鱼类免疫学的发展起到重要的推进作用。