C1,2位脱氢反应是工业上生产甾体药物的重要反应,简单节杆菌(Arothrobacter simplex)则是研究和应用最广泛的C1,2位脱氢菌株。目前在国内主要是利用简单节杆菌对醋酸可的松(CA)进行脱氢反应,从而实现醋酸泼尼松(PA)的工业化生产,简单节杆菌高效脱氢菌株的改造对甾体药物的生产具有重要意义。本研究以来源于简单节杆菌的3-甾酮-Δ1-脱氢酶(KsdD)为研究对象,构建高表达3-甾酮-Δ 1-脱氢酶基因的工程菌株,并尝试建立简单节杆菌的基因敲除体系。克隆简单节杆菌来源的KsdD基因,构建于表达载体pART2中,以简单节杆菌为表达宿主,成功构建7株过表达工程菌株,分别为pART2-WT、pART2-W299A、pART2-W299G、pART2-KsdD1、pART2-KsdD2、pART2-KsdD3、pART2-KsdD4。通过全细胞转化和HPLC分析方法,使用过表达工程菌株对5种甾体化合物(醋酸可的松、可的松、雄烯二酮、甲睾酮、睾酮)进行全细胞转化分析。结果表明,由色氨酸突变为丙氨酸和甘氨酸的pART2-W299A、pART2-W299G工程菌株转化效率高于pART2-WT、pART2-KsdD3工程菌株和对照菌株;而 pART2-KsdD1、pART2-KsdD2、pART2-KsdD4工程菌株在底物转化中表现出了选择偏好性。基于同源重组策略,采用pK18mobsacB质粒构建携带KsdLD3上下游同源臂的自杀质粒,电转化至简单节杆菌,通过筛选验证并未得到期望的敲除菌,可能是蔗糖果聚糖基因(SacB)不能在简单节杆菌中起到反向筛选的作用。通过CRISPR/Cas9基因编辑技术,构建了携带有Cas9基因、KsdD3 N20的sgRNA、删除pART2质粒sgRNA的敲除载体,电转化简单节杆菌,亦未得到敲除菌株。经过分析,对敲除载体进行了改良及敲除方案的调整,得到4个优化重组敲除质粒(pAS481、pAS482、pAS491、pAS492),但其敲除体系的可行性正在进一步验证。