稻瘟病菌激活蛋白活性测定与基因的克隆表达

来源 :沈阳农业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:zcznq
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本文针对新型植物蛋白激发子生物农药——稻瘟菌激活蛋白进行了深入的研究,主要包括稻瘟菌激活蛋白的基因定位、稻瘟菌激活蛋白提纯、蛋白的活性测定和基因克隆及表达等方面,结果如下: 1、通过NCBI网上查询,将稻瘟菌激活蛋白基因序列与已测定的稻瘟菌基因组序列进行比对,得出此蛋白基因位于稻瘟菌基因组的第3条染色体上。 2、分别用pH为6.5、7.0、7.5、8.0的磷酸提取缓冲液和Tris-HCL提取缓冲液从稻瘟菌菌块中提取稻瘟菌激活蛋白,对比不同缓冲液提取的结果来看,用Tris-HCL提取缓冲液提取的42KD蛋白条带较为清晰,用磷酸提取缓冲液提取的42KD蛋白条带浓度比用Tris-HCL提取缓冲液提取的高,但是用磷酸提取缓冲液提取的其它杂蛋白数量相应增多,其浓度也相应升高;对比不同pH值来看,pH值为7.5的Tris-HCL提取缓冲液提取的蛋白条带比其它要清晰,pH值为8.0的磷酸提取缓冲液提取的蛋白条带明显弱于其它3种。因此在提取日本稻瘟菌激活蛋白时用pH值为7.5的Tris-HCL提取缓冲液提取的效果比较好。 3、用激活蛋白处理丝瓜、豌豆和番茄种子,观测其发芽及幼苗生长情况,结果显示本稻瘟菌激活蛋白能显著促进丝瓜、豌豆和番茄种子的发芽和幼苗的生长;从日本稻瘟菌激活蛋白对水稻生长的影响来看,稀释100倍的日本稻瘟菌激活蛋白对水稻的生长有较大的促进作用。用稻瘟菌处理烟草悬浮培养细胞的培养液之后进行纤维素酶、过氧化物酶和苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性测定,在处理1h后均与对照产生较明显的差异。因此可将其作为蛋白活性的快速检测指标。 4、根据引物设计原则和目的基因序列设计引物,以提取的稻瘟菌基因组DNA为模板,分别扩增出目的蛋白基因DW-1和DW-2,继而分别构建非融合表达载体pBV221-DW-1和融合表达载体pGEX-KG-DW-2。将构建好的两个载体分别进行温度诱导与IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳分析结果表明连有目的蛋白的pGEX-KG-DW-2载体加诱导物在BL21中表达,在比66KD稍大处有一条特异性带。 因此,稻瘟菌激活蛋白是一种具有广阔市场前景,对多种植物有抗病、抗虫功效同时又可促进多种植物生长的新型生物农药。
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