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研究目的:膀胱癌占我国泌尿生殖系肿瘤发病率的第一位,并呈逐年上升趋势。多数膀胱癌可以在早期诊断,但复发和进展率很高,Ⅳ期膀胱癌的5年生存率仅为15%,严重危害患者健康及生存质量。临床上治疗膀胱癌的常规药物由于一系列不良反应导致疗效不佳。而一些天然药物在抗肿瘤方面具有药效温和、不良反应小等优点,其中大量文献证明紫草素能够抑制多种癌细胞增殖,但对膀胱癌细胞的作用机制目前尚不明确。本文以人膀胱癌EJ细胞为主要研究对象,初步探讨紫草素诱导膀胱癌细胞死亡的机制,为紫草素的研发提供理论基础和实验依据,也为膀胱癌治疗提供新的思路。研究方法:紫草素以不同的浓度和时间刺激膀胱癌细胞后,通过MTT检测和细胞克隆实验确定紫草素对细胞增殖的影响。紫草素刺激的EJ细胞经不同方法处理后,利用流式细胞仪检测细胞内活性氧水平以及线粒体膜电位的变化;通过Western Blot检测自噬、程序性坏死、Nrf2途径相关蛋白的表达变化;利用免疫荧光检测紫草素对LC3、Nrf2蛋白表达量的影响;免疫共沉淀法检测RIP1与RIP3、Nrf2与Keapl分别形成复合体的情况;并采用核质分离实验检测Nrf2蛋白表达量的变化。此外,EJ细胞分别使用活性氧清除剂NAC、自噬抑制剂LY294002和RIP1特异性抑制剂Nec-1预处理后与紫草素联合作用,通过Western Blot检测自噬、程序性坏死、Nrf2途径相关蛋白表达量的变化;免疫共沉淀法检测NAC对RIP1-RIP3复合体表达的影响;MTT检测紫草素分别与NAC、LY294002、Nec-1、ML385、z-VAD联合作用对EJ细胞存活率的影响。研究结果:1.紫草素以浓度依赖和时间依赖的方式降低膀胱癌细胞(EJ、J82、BIU87、T24、UMUC3)存活率,抑制细胞增殖,而细胞克隆实验也进一步表明紫草素能够明显抑制EJ细胞增殖;2.紫草素作用于人膀胱癌EJ和J82细胞,明显增加自噬相关蛋白LC3、Beclin1、ATG5、ATG7、ATG12表达量,并呈现浓度依赖性和时间依赖性;免疫荧光检测结果显示,随着紫草素作用于EJ细胞的时间延长,LC3蛋白表达量明显增加;3.紫草素以浓度依赖和时间依赖的方式上调人膀胱癌EJ和J82细胞中程序性坏死相关的RIP1、RIP3、p-MLKL蛋白表达量;免疫共沉淀结果显示,紫草素作用的人膀胱癌EJ细胞中,RIP1与RIP3复合体增多;MTT检测结果显示,抑制剂z-VAD对EJ细胞存活率没有影响,而抑制剂Nec-1使EJ细胞存活率明显发生逆转;4.紫草素刺激EJ细胞使线粒体膜电位降低,细胞内活性氧水平显著增加,并呈浓度依赖性;5.紫草素上调了 EJ和J82细胞中Nrf2途径相关蛋白的表达,并呈现时间依赖性;免疫共沉淀结果显示,紫草素处理的EJ细胞中,Nrf2与Keap1复合体减少;核质分离及免疫荧光实验表明,12h时Nrf2蛋白的入核量最多;MTT检测结果显示,抑制剂ML385能够增强紫草素对EJ细胞的毒作用;6.活性氧清除剂NAC与紫草素联合作用于EJ和J82细胞后,自噬、程序性坏死以及Nrf2途径的关键执行蛋白表达量明显下调;免疫共沉淀结果显示,紫草素诱导的RIP1与RIP3复合体因NAC预处理而明显减少;MTT结果显示,NAC几乎完全逆转紫草素诱导的细胞存活率;7.抑制剂LY294002进一步上调EJ和J82细胞中紫草素诱导的RIP1、RIP3蛋白表达,而Nec-1能够增加紫草素诱导的LC3、Beclin1蛋白表达量;MTT结果显示,抑制剂3-MA、LY294002分别预处理EJ细胞,紫草素诱导的细胞存活率均降低,但Nec-1与紫草素联合作用,EJ细胞存活率明显增加。研究结论:紫草素通过使ROS过度产生引起氧化应激反应,激活Nrf2途径并诱导自噬和程序性坏死的发生,从而抑制膀胱癌细胞增殖。此外,抑制自噬可以显著增强紫草素诱导的程序性坏死。因此,紫草素可以作为一种潜在的抗膀胱癌药物,且合理抑制自噬能够有效增加膀胱癌细胞对紫草素的敏感性,这可能会成为一种有前景的治疗手段。