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哮喘(Asthma)是种以气道高反应性(AHR)、可逆性气流阻塞以及气道壁重构为主要特征的慢性炎症性疾病。多种细胞特别是肥大细胞、嗜酸性粒细胞和T淋巴细胞等都涉及到哮喘的致病过程。哮喘的发病是遗传因素和环境因素综合作用的结果,涉及多种基因以及蛋白的作用及其信号通路,其中多种G蛋白偶联受体(G Protein-Coupled Receptors, GPCRs)在哮喘中发挥着重要的调控作用。GPR97是一种粘附性G蛋白偶联受体,高表达于多种免疫细胞中,如：肥大细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞等,但GPR97在过敏性哮喘疾病中的作用尚无报道,在肥大细胞中发挥的功能尚不清楚。本文拟建立稳定的哮喘模型,探究GPR97基因对肥大细胞功能的影响以及在哮喘发病过程中的作用。研究内容和结果概述如下：1、哮喘小鼠模型的构建与评估。本实验采用卵清蛋白(OVA)致敏和激发的方法建立小鼠哮喘模型。小鼠分别用50μg、100μg、25OμgOVA致敏,1%OVA激发,建立小鼠哮喘模型,并通过行为学和多种生理生化指标进行评价。行为学观察发现,模型组小鼠均出现抓耳挠腮、弓背、大小便失禁等症状；肺重体重比统计发现,模型组肺重占体重的比例明显增加,表明肺部水肿随致敏OVA浓度增大而加重；肺组织H&E染色发现,随着致敏OVA浓度增大,模型组小鼠肺部气道壁重构现象更为明显,主要表现为支气管上皮增厚,气道、血管周围炎症细胞大量浸润；肺泡灌洗液中总细胞计数结果表明,炎症细胞的数目随OVA浓度的增大而增多。接着,通过免疫学和生化方法检测了几种炎症细胞的变化情况：通过肺组织中嗜酸性过氧化物酶(EPO)的活性间接检测了肺组织中嗜酸性粒细胞的含量,肺组织PAS染色检测肺部高脚杯细胞增生、粘液分泌状况,肺组织肥大细胞免疫组化检测了肥大细胞在肺部的分布及数目。以上实验均表明,随着致敏OVA的浓度增大,肺部这三种细胞的比例增加明显。最后,采用RT-PCR和ELISA方法检测Th1、Th2相关炎症因子IL-4、IL-6、IL-13、IFN-γ以及血清中总IgE的表达。结果发现IL-4、IL-6、IL-13、IgE的表达均随致敏OVA浓度增大而上调,但IFN-γ的表达呈下调趋势。上述实验表明,哮喘发生过程中,Th2的优势分化非常明显。2、哮喘细胞模型的建立及评价。原代分离小鼠骨髓细胞,IL-3和SCF诱导向肥大细胞分化。诱导四周后,FACS检测证实分离纯化得到较纯的肥大细胞。用哮喘模型血清致敏,OVA激发,荧光定量PCR和ELISA方法检测与肥大细胞相关炎症因子的分泌。发现OVA诱导下,肥大细胞分泌产生较多的IL-4、IL-6、IL-13三种炎症因子。3、GPR97在哮喘中的作用。首先,分离原代WT和GPR97-/-小鼠骨髓细胞,并诱导向肥大细胞分化,间时建立哮喘细胞模型。荧光定量PCR和ELISA方法检测IL-4、IL-6、IL-13三种炎症因子,发现与WT小鼠相比,这三种细胞因子在GPR97-/-小鼠分化来的肥大细胞中的表达均下调。其次,以250μgOVA作为致敏浓度,同时建立和评估WT和GPR97-/-小鼠哮喘模型。通过WT和GPR97-/-小鼠行为学观察、肺重体重比统计、肺组织H&E染色、嗜酸性粒细胞含量检测、肺组织PAS染色、肥大细胞免疫组化检测、荧光定量PCR和ELISA检测Th1、Th2相关炎症因子及血清中总IgE的表达。结果发现WT和GPR97-/-小鼠哮喘发病症状在肺部水肿、气道重构和粘液分泌、肥大细胞和嗜酸性粒细胞的含量及细胞因子的RNA水平和蛋白水平都没有显著性差异。综上所述,本课题发现250μg/只的OVA作为致敏药物浓度,腹腔注射致敏14天(7天/次)后,用OVA雾化激发7天能建立安全稳定的小鼠哮喘模型,这为我们后续开展基因敲除鼠哮喘相关研究提供了有利的保证。GPR97基因能显著影响肥大细胞细胞因子的分泌,但对小鼠哮喘的发生没有显著作用。