目的: 从五脏藏神的理论出发,探讨脾胃与神志之间的密切联系。通过检测脾虚模型大鼠 AVP、OT、NPY 肽的含量和基因表达的变化,以期揭示脾虚对大鼠学习记忆影响的机制,深化脾胃与神志的理论和实验研究,进而为中医临床从脾论治神志疾病提供实验依据。方法: 以 Wistar 大鼠为研究对象,采用耗气破气、饮食失节、劳倦过度三者相结合的方法,建立脾虚动物模型。记录大鼠的体重、进食量、外观表现和动态变化。采用免疫组化的方法检测 AVP、OT、NPY 阳性反应物的积分光密度(IOD)和平均光密度(MOD),来表示神经肽水平的相对含量。进而用原位杂交的方法测定 AVP、NPY 的 mRNA 表达变化,从分子水平揭示脾虚模型脑内神经肽的基因表达变化,从而丰富和提高脾藏神理论。理论基础: 本课题研究的理论基础是五脏藏神理论。而在五脏皆藏神的整体协调关系中,脾胃起着枢轴或曰关键的作用,对“藏神”整体影响重大。其一,脾胃是“后天之本”,气血化生之源, 灌溉滋养周身,气血是神志活动的物质基础,人体正常神志活动的有赖于脾胃的健旺,气血的充足。其二,脾胃居中央,是生命活动(气机运转)的“枢轴”。人的神志活动平衡的调节,取决于气机升降平衡,而脾胃则是气机升降的枢纽。脾升、胃降相互协调,气机升降有序,从而保持了脏腑活动、神志活动调节之平衡。结果:(1) 采用耗气破气、饮食失节、劳倦过度三者相结合的方法,建立的脾虚大鼠模型从第三天开始出现类似脾虚的症状:大便溏泻、体重减轻、消瘦、扎堆、精神萎靡等。第八天症状最重,出现耳尾色淡、毛色枯槁等。 用归脾汤防治的治疗组大鼠上述症状不甚明显,大便为成形稀便,体重下降不明显,反应灵敏、皮毛白而有光泽。 A、B 方对照组也表现为不同程度的泄泻、稀便、脱肛、扎堆、拱背、脱毛等现象,但与模型组相比有所改善。(2) 脑内神经肽 AVP、OT 和 NPY 的免疫组化结果 本实验在大鼠脾虚造模后用免疫组化的方法测定了海马 CA1 区、下丘脑腹侧核、前额叶皮层的 AVP、OT 和 NPY 阳性细胞的表达,发现脾虚模型组 AVP、NPY 的免疫阳性反应物的积分光密度(IOD)值和平均光密度(MOD)值显著下降,尤以下丘脑和前额叶皮层显著(P<0.01),说明 AVP、NPY 的含量减少,参与合成的细胞数降低。因而推断脾虚造模后出现的学习记忆障碍与多脑区内 AVP、NPY 肽的含量显著下降有关,从而产生学习记忆能力的下降。 OT 免疫阳性反应物在下丘脑腹侧核和前额叶皮层的 IOD 值和 MOD 值显著II脾虚模型脑内神经肽及其基因表达的研究增加(P<0.01),而在海马 CA1 区增加不明显,说明在下丘脑腹侧核、前额叶皮层的 OT 的含量增加,参与合成的 OT 细胞数增多。从 OT 的功能和实验结果来推测: 脾虚模型可能促使下丘脑腹侧核、前额叶皮层的 OT 含量增加,从而导致渐进性遗忘,这可能是脾虚导致大鼠学习记忆能力下降的原因之一。治疗组用归脾汤益气健脾加以防治,其海马 CA1 区、下丘脑腹侧核、前额叶皮层的 AVP 和 NPY 免疫阳性反应物的 IOD 值和 MOD 值明显高于模型组,与正常组接近或高于正常组。而在下丘脑腹侧核、前额叶皮层的 OT 免疫阳性反应物的 IOD 值和 MOD 值明显低于模型组,可以推知归脾汤通过益气健脾,化运气血,起到了改善学习记忆下降的作用。A 方对照组用柴胡疏肝散治疗,在下丘脑对 AVP 的含量有上调作用,但在海马 CA1 区和前额叶皮层无明显调节作用。B 方对照组用天王补心丹治疗,在海马 CA1 区、下丘脑腹侧核和前额叶皮层都有上调作用,结果与治疗组相近。A 方对照组和 B 方对照组在海马 CA1 区对 NPY 均有下调作用,但在下丘脑和前额叶皮层均无明显调节作用。A 方对照组和 B 方对照组对 OT 这种神经肽的含量在下丘脑和前额叶皮层也有下调作用,但是调节无显著意义。(3)脑内神经肽 AVP、NPY 的 mRNA 表达结果脾虚模型大鼠 AVP 的 mRNA 表达水平明显低于正常组和治疗组,差异有显著意义。而正常组和治疗组之间 AVPmRNA 表达水平则无显著性差异。此结果与 AVP 免疫阳性反应物的变化趋势基本一致,提示脾虚对学习记忆的影响与AVP 基因及其肽的功能有关。脾虚模型大鼠 NPYmRNA 在海马 CA1 区、下丘脑腹侧核、前额叶皮层 IOD值明显低于正常组,差异有显著意义。结合实验一的免疫组化实验,脾虚模型大鼠 NPY 免疫阳性细胞的 IOD 值也显著低于正常组,差异有显著意义,与NPY 的 mRNA 表达变化趋势基本一致,提示脾虚对学习记忆的影响也与 NPY 基因及其肽的功能有关。与模型组相比较,治疗组用归脾汤预防性治疗脾虚,AVPmRNA 的 IOD 值和MOD 值明显增加,说明归脾汤对 AVP 这种神经肽的功能具有上调作用。治疗组在前额叶皮层的 NPY mRNA 的 IOD 值和 MOD 值也明显增加,但在海马 CA1 区和下丘脑腹侧核的增加不显著,推测归脾汤对 NPY mRNA 的调节可能在前额叶皮层,而对海马 CA1 区和下丘脑腹侧核的调节不强,其机理有待研究。与模型组相比较,柴胡疏肝散组在海马、下丘脑、皮层的 AVPmRNA 阳性反应物基因表达无明显差异(P>0.05),说明柴胡疏肝散对 AVP 这种神经内分泌细胞的合成功能无调整作用。但是柴胡疏肝散组 NPYmRNA 表达在下丘脑腹侧核?