研究背景：随着各种新型免疫抑制剂的问世,移植外科技术的进步,器官移植已经成为了治疗器官功能衰竭最佳的方案。然而,器官移植术后长期、大剂量使用免疫抑制剂所导致的严重副作用(如重症感染、骨髓抑制、糖代谢紊乱等)却显著影响了移植受体的长期生存。因此,如何诱导受体产生供体特异性免疫耐受,减少免疫抑制剂的大量使用,成为了移植免疫界一直以来的研究重点。上个世纪以来,研究者们发现骨髓间充质干细胞(Mesenchymal stem cells, MSCs)不仅具有定向分化能力,同时还具有一定的免疫抑制作用。体外实验证实MSCs可在一定程度内抑制T细胞的活化与增殖,诱导移植免疫耐受形成,因此MSCs已被广泛应用于移植免疫耐受的研究中。但同时有研究显示,MSCs相对于CD4+CD25+Tregs等具有显著免疫抑制作用的细胞而言,其免疫抑制作用相对较弱。具体体现在：相同比例的CD4+CD25+Tregs对效应性T细胞产生的免疫抑制效应明显强于骨髓间充质干细胞；部分器官移植动物实验证实,骨髓间充质干细胞不仅不能有效抑制急性排斥反应的发生,更不能诱导移植免疫耐受的形成。另外有报道称虽然MSCs具有明确的免疫抑制作用,但将其应用于临床,诱导受体产生供体特异性免疫耐受仍面临较多问题：①MSCs诱导免疫耐受形成的主要分子及细胞机制仍不十分清楚；②MSCs的免疫抑制效应较弱,即使使用较高剂量其产生的免疫抑制效应仍低于常规免疫抑制剂；③MSCs在体的存活时间不长,短时间内难以诱导耐受形成；④大剂量使用MSCs具有一定风险,如血管微血栓形成及器官梗死、致瘤、感染等；⑤大批量培养生产MSCs以供临床使用,不具备可操作性。因此,应用骨髓间充质干细胞防治移植排斥反应,诱导移植免疫耐受形成的观点仍具有争议。结合既往研究结果,我们认为上述问题的关键可能在于野生型骨髓间充质干细胞的免疫抑制作用相对低下。因此,如何增强骨髓间充质干细胞的免疫抑制作用,使其在安全剂量范围内即可达到理想的免疫抑制效应；增强骨髓间充质干细胞的免疫抑制作用后是否可诱导受体免疫耐受形成,成为了本实验的研究的方向。MSCs产生免疫抑制作用的机制包括细胞-细胞接触及其分泌的细胞因子。其中一个重要的分子机制即为MSCs所分泌的抑制性细胞因子——吲哚胺2,3-双加氧酶(Indoleamine 2,3-Dioxgenase, IDO)。体外实验证实,采用IDO抑制剂1-MT阻断IDO的作用后,MSCs的免疫抑制作用被大大削弱甚至消除。另外,有动物实验发现啮齿类动物骨髓间充质干细胞极低水平表达IDO蛋白；IDO浓度与免疫耐受的形成密切相关。因此通过基因转染技术,使兔源性骨髓间充质干细胞高表达IDO蛋白,是否可增强骨髓间充质干细胞的免疫抑制作用,最终诱导供体特异性免疫耐受值得研究。目的：通过慢病毒转染技术,将兔源性IDO基因转入兔骨髓问充质干细胞内,增强MSCs的免疫抑制作用,诱导CD4+CD25+Tregs生成。并通过上调Tregs对抑制性协同刺激分子CTLA-4及免疫抑制性细胞因子IL-10、TGF-β的表达,提升Tregs的抗原特异性免疫抑制作用,从而防治急性排斥反应,诱导供体特异性移植免疫耐受的形成。方法：1.兔骨髓间充质干细胞的分离与培养：因家兔属啮齿科动物,各品系遗传稳定,且便于肾移植手术的实施,故本研究采用家兔骨髓间充质干细胞及移植模型作为研究对象。骨穿针穿取兔股骨获得骨髓悬液。密度梯度离心法获取骨髓悬液中单个核细胞层。于DMEM/F12完全培养基内贴壁生长两天后去除悬浮细胞,继续培养七天后传代。2.携带IDO基因慢病毒的构建：GenBank搜索获得兔源性IDO基因序列信息。RT-PCR扩增、纯化IDO序列。酶切消化慢病毒载体质粒GV218后,将扩增的IDO序列与之拼接,挑选阳性克隆(pGC-FU-GFP-IDO)。纯化的阳性克隆质粒与载体质粒pHelper1.0 及 pHelper2.0共同转染入293细胞内,使目的基因与慢病毒载体在293细胞内重组整合为携带IDO基因的慢病毒(pGC-FU-GFP-IDO lentivirus)。3.慢病毒感染骨髓间充质干细胞：感染前12小时消化调整MSCs密度为4.5×103/孔,将其于六孔板内贴壁培养12小时后加入1ml含ploy brene的增强感染液及空载慢病毒(pGC-FU-GFP lentivirus MOI=100)或IDO阳性慢病毒(pGC-FU-GFP-IDO lentivirus MOI=120)。待细胞贴壁长满后加入20ug Fe/ml Molday ION Rhodamine B继续培养12小时。消化上述MSCs并制悬,以备动物模型注射使用。4.免疫蛋白印迹分析：慢病毒转染的MSCs在500IU/ml IFN-γ环境下培养3天,收集细胞裂解液。以兔源IDO单克隆抗体行免疫蛋白印迹(Westernblot)分析。5.混合淋巴细胞培养：为了检测野生型MSCs (WT-MSCs)、空载病毒转染MSCs (Lenti-MSCs)及IDO慢病毒转染MSCs (IDO-MSCs)对T淋巴细胞的免疫抑制作用,三种细胞均按MSCs:T=1：1； 1：25； 1：50； 1：100的比例与2×10。个CD4+CD25-Teffs共培养72小时。于培养结束前16小时加入。H-tritiated thymidine (3H-TdR),测定CPM值以反映T细胞增殖情况；为了检测转染MSCs诱导Tregs产生的抗原特异性免疫抑制作用,新西兰兔来源的转染MSCs与日本大耳白兔来源的PBMCs共培养72小时后,采用流式分选技术分选其中的CD4+CD25+Tregs及CD4+CD25T细胞。其中CD4+CD25+Tregs作为抑制细胞,CD4+CD25-T细胞作为反应细胞,Y射线灭活的新西兰兔来源PBMCs作为刺激细胞。抑制细胞、刺激细胞及反应细胞按1：2：2比例混合培养72小时后同上述方法测定其CPM值；6.流式细胞分析及细胞分选：外周血单个核细胞(PBMCs)与慢病毒转染MSCs共培养后采用FITC-CD4、 APC-CD25、PE-Foxp3单克隆抗体染色,利用流式细胞术检测共培养PBMCs中CD4+CD25+Tregs的含量；采用FITC-CD4及APC-CD25单克隆抗体染色后,利用流式细胞分选技术,分选出CD4+CD25+ T细胞(即CD4+CD25+Tregs)及CD4+CD25-T细胞(即CD4+CD25-Teffs)亚群；利用FITC-CTLA-4单克隆抗体染色后,流式细胞技术检测Tregs表面CTLA-4的表达情况。7. Real-Time PCR:PBMCs与慢病毒转染MSCs共培养后,根据Foxp3的特异性引物序列行RT-PCR,检测共培养PBMCs中Foxp3的表达情况。8.兔原位肾移植：常规切取新西兰兔左。肾作为供肾。同时切除受体日本大耳白兔左肾,并将供肾行原位肾动、静脉、输尿管端-端吻合,最后切除受体右肾。受体根据治疗方案分为以下5组(各组n=5)：①对照组(Control):肾移植术后接受PBS静脉注射治疗；②环孢素A治疗组(CsA)：肾移植术后立即静脉注射10mg/Kg环孢素。术后15天,每天接受上述剂量环孢素治疗,此后改为每周三次上述剂量环孢素治疗；③野生MSCs治疗组(WT-MSCs):’肾移植术后立即经肾动脉注射2×10。/Kg WT-MSCs治疗；④空载病毒转染MSCs组(Lenti-MSCs):肾移植术后立即经肾动脉注射2×106/Kg Lenti-MSCs治疗；⑤IDO转染MSCs组(IDO-MSCs):肾移植术后立即经肾动脉注射2X 106/KgIDO-MSCs治疗。9.术后监测及供体特异性皮肤移植：于肾移植术后第1,7,14,28,49天分别采集受体外周血,监测血清肌酐、IL-2、IL-10、TGF-β等细胞因子及CD4+CD25+Tregs水平。术后第7天及第14天分别收获Control组及其他组别的移植肾组织行病理学检查(n=3),根据Banff评分系统评判移植肾病理得分。同时,移植肾组织切片后行激光共聚焦扫描检测,分析输注的MSCs的分布情况。为了验证IDO-MSCs组中长期存活受体疫耐受的形成,取IDO-MSCs组中长期存活受体(生存天数>90天)的外周血并分离PBMCs细胞。受体PBMCs细胞与供体新西兰兔来源、非供体新西兰兔来源及第三方日本大耳白兔来源的PBMCs (辐照灭活)按1：1混合,培养72小时后测定其CPM值,明确培养体系中淋巴细胞活化增殖状态。同时,长期存活的受体接受供体新西兰兔来源、非供体新西兰兔来源及第三方日本大耳白兔来源的背部全层皮片移植,移植后每天观察移植皮片的存活情况。结果：1.兔骨髓间充质干细胞的分离与培养：采集的骨髓细胞经培养3小时后开始贴壁,48小时后贴壁细胞变形,呈典型的纺锤体状或纤维细胞样生长。培养六天后原代MSCs融合达80%,予传代。传代细胞培养三天后,细胞融合即可达80%以上,可稳定传代生长。2.IDO基因慢病毒的构建及MSCs转染：质粒载体GV218经AgeI酶切后,加入扩增IDO序列(PCR产物大小：1243bp)构建重组质粒。重组质粒转染293T细胞后于细胞内合成阳性克隆慢病毒并分泌于外周培养基内。收集病毒上清并提纯,最终病毒滴度检测结果为2×108TU/ml。第三代(P3)MSCs按MOI=100及120分别感染空载病毒pGC-FU-GFP 及 IDO阳性病毒pGC-FU-GFP-IDO24小时后,于倒置荧光显微镜下观察到贴壁细胞发出浅淡绿色荧光,细胞感染率20%-30%。96小时后荧光强度达峰,80%以上MSCs高强度表达绿色荧光蛋白。3.IDO慢病毒转染MSCs稳定高表达IDO蛋白：慢病毒转染MSCs全细胞裂解后经免疫蛋白印迹(Westernblot)分析,在500IU/mlIFN-γ作用下,野生型及空载病毒转染MSCs极低水平表达IDO蛋白,而pGC-FU-GFP-ID O病毒转染MSCs可稳定高表达IDO蛋白(分子量大小43KDa)。4.IDO转染可增强MSCs对CD4+CD25-T增殖的抑制作用：单向淋巴细胞混合实验(MLR)结果显示：C D4+CD25- T在PHA刺激下明显增殖。CD4+CD25- T与各类MSCs按1：1、25：1、50：1、100：1混合培养后,部分MSCs比例条件下的T细胞增殖受到抑制；CD4+CD25-T细胞增殖抑制程度与MSCs细胞比例正相关。相同细胞比例条件下,IDO-MSCs对CD4+CD25- T细胞的增殖抑制程度明显强于其他MSCs。WT-MSCs与Lenti-MSCs 仅在 MSCs:T比例为1：1至1：25时,表现出抑制功能,当MSCs：T比例达到1：50后,MSCs对T细胞的免疫抑制作用基本消失,而IDO-MSCs仍可发挥免疫抑制功能。5.IDO转染MSCs明显增强CD4+CD25+Tregs的抗原特异性免疫抑制作用：日本大耳白兔来源的PBMCs与新西兰兔来源的WT-MSCs、Lenti-MSCs、 IDO-MSCs共培养后,经流式细胞技术分选出的CD4+CD25+Tregs作为抑制细胞。按日本大耳白兔来源CD4+CD25-T:γ射线灭活的新西兰兔来源PBMCs:抑制细胞=2：2：1的比例共培养72小时后,检测培养体系中淋巴细胞增殖情况。结果显示IDO-MSCs共培养的Tregs抑制效应性T细胞增殖的抑制率较其他实验组明显升高,差异具有统计学意义(P<0.05)。而其他各组间的细胞增殖抑制率无明显统计学差异(P>0.05)。6.IDO转染骨髓间充质干细胞明显诱导CD4+CD25+Tregs生成：PBMCs与WT-MSCs、Lenti-MSCs或IDO-MSCs共培养72小时后,经流式细胞技术分析。结果显示WT-MSCs 及 Lenti-MSCs分别与PBMCs共培养后,PBMCs中的CD4+CD25+Tregs比例较无MSCs共培养组明显升高(P<0.05)。然而IDO-MSCs与PBMCs共培养中,Tregs比例较WT-MSCs及Lenti-MSCs共培养组明显升高(P<0.05)。另外,据RT-PC R结果得知,WT-MSCs及Lenti-MSCs 与 PBMCs共培养后可上调Foxp3的表达水平,而IDO-MSCs较WT-MSCs及Lenti-MSCs可更显著上调Foxp3的表达水平(P<0.05)。7.IDO转染骨髓间充质干细胞诱导Tregs表达CTLA-4:CTLA-4为CD4+CD25+Tregs发挥抑制作用的主要共抑制分子。本实验研究发现WT-MSCs及Lenti-MSCs 与 CD4+CD25+Tregs共培养后,可在一定程度上调CD4+CD25+ Tregs表达的CTLA-4分子；而当CD4+CD25+Tregs与IDO-MSCs共培养后,其表面CTLA-4分子的表达水平较WT-MSCs及Lenti-MSCs共培养组明显升高(P<0.05)。8.IDO转染骨髓间充质干细胞诱导Tregs分泌IL-10、TGF-β:不同MSCs与CD4+CD25+Tregs共培养后,经ELISA分析共培养上清的细胞因子浓度。结果显示：Tregs分别与WT-MSCs、Lenti-MSCs及IDO-MSCs共培养后,IDO-MSCs共培养组中的IL-10及TGF-β水平明显高于WT-MSCs及Lenti-MSCs共培养组(P<0.05),但各共培养组中的PGE2分泌水平却无明显统计学差异(P>0.05)。9.IDO转染骨髓间充质干细胞减轻排斥反应,延长移植肾存活时间并诱导受体免疫耐受：分别于术后1、7、14、28、49天检测血清肌酐水平(SCr),结果显示对照组移植肾功能持续恶化,移植后第7天SCr明显升高(P<0.05)。WT-MSCs与Lenti-MSCs治疗组SCr于移植后第14天明显升高(P<0.05),且明显高于CsA与IDO-MSCs治疗组(P<0.05)。同时,移植肾病理检查结果提示：CsA与IDO-MSCs治疗组移植肾基本保持正常肾脏形态,仅伴有少量局灶性单核细胞浸润肾小球,肾小管及血管区无明显浸润。对照组移植肾则有大量炎性浸润,表现为大量单核细胞及淋巴细胞浸润肾小管及血管区。肾小管上皮细胞肿胀、脱落、坏死,小管内大量管型；肾血管管壁炎性浸润伴纤维素样坏死。与对照组类似,WT-MSCs与Lenti-MSCs治疗组在肾间质也出现了大量的炎性浸润,甚至部分小动脉管壁出现纤维素样坏死。生存曲线分析结果显示：WT-MSCs与Lenti-MSCs治疗组平均生存天数长于对照组,P<0.05)；而IDO-MSCs与CsA治疗组的生存天数则明显长于WT-MSCs与Lenti-MSCs治疗组(P<0.05)。然而,IDO-MSCs与CsA治疗组间的生存天数无明显统计学差异(P>0.05)。在监测受体移植肾功能的同时,本实验也对受体的免疫状态进行了追踪。ELISA结果显示所有实验组受体体内IL-2水平在术后均有不同程度的升高,尤其是对照组,于术后7天达峰(P<0.05)。在WT-MSCs与Lenti-MSCs治疗组中,IL-2于术后14天达峰(P<0.05),且均明显高于CsA及IDO-MSCs治疗组。在IDO-MSCs治疗组中,IL-2水平于术后14天回到并保持术前水平。然而,在CsA治疗组中IL-2水平于术后7天持续下降,术后49天仍明显低于术前水平(P<0.05)。类似的,IL-10及TGF-p水平在IDO-MSCs中持续升高(P<0.05),而在对照组及WT-MSCs与Lenti-MSCs治疗组中,IL-10及TGF-p水平明显降低(P<0.05)。流式细胞技术监测受者外周血中CD4+CD25+Tregs含量,结果显示IDO-MSCs治疗组中Tregs含量明显高于其他各实验组(P<0.05)。另外,为了验证IDO-MSCs诱导受体长期免疫耐受的形成,本实验对长期存活的IDO-MSCs治疗组进行了MLR及供体特异性皮肤移植实验。MLR结果显示：受体日本大耳白兔来源的PBMCs细胞与供体新西兰兔来源的PBMCs共培养后,淋巴细胞的增殖程度明显低于与非供体新西兰兔来源、第三方(无关方)日本大耳白兔来源的PBMCs共培养组(P<0.05)。同时,供体特异性皮肤移植实验结果显示：IDO-MSCs治疗组中,长期存活的肾移植受体,可在无抗排斥药物的干预下,长期接受供体来源的皮片移植,但却明显排斥非供体新西兰兔来源及第三方日本大耳白兔来源的皮片。结论：1、慢病毒载体可将兔源性IDO基因成功转入兔骨髓间充质干细胞,并使兔骨髓间充质干细胞稳定、持续、高水平表达IDO蛋白。2、IDO转染骨髓间充质干细胞后,可增强骨髓间充质干细胞对效应性T细胞的直接免疫抑制作用。3、IDO转染骨髓间充质干细胞后可增强骨髓间充质干细胞诱导CD4+CD25+Tregs生成的作用。同时,IDO转染的骨髓间充质干细胞通过上调Treg表达的CTLA-4及IL-10、TGF-β而增强Tregs的抗原特异性免疫抑制效应。4、 IDO转染的骨髓间充质干细胞可通过诱导CD4+CD25+Tregs的生成并增强Tregs的免疫抑制作用,一定程度内减轻急性排斥反应,延长受体生存时间,诱导部分受体形成供体特异性移植免疫耐受。综上所述,慢病毒介导的基因转染技术可有效将兔源IDO基因转入兔骨髓间充干细胞内,并使其高水平表达IDO蛋白,从而增强骨髓间充质干细胞的免疫抑制作用,诱导CD4+CD25+Tregs生成,并增强CD4+CD25+Tregs的抗原特异性免疫抑制作用,减轻急性排斥反应,最终诱导部分受体产生供体特异性移植免疫耐受。以上研究结果为探讨骨髓间充质干细胞诱导免疫耐受形成的机制提供了一种细胞及分子理论,更为临床应用骨髓间充质干细胞防治移植排斥反应、诱导供体特异性免疫耐受打下坚实的基础。