随着荧光技术的不断发展,具有设计简单、响应快速并可实现原位、实时检测等优点的荧光探针在食品安全、环境监测、疾病诊断等领域的研究也取得了较大的发展,展现了巨大的应用潜力。利用荧光探针监测生命活动相关的物质,对疾病的早期诊断和治疗具有非常重要的意义。虽然传统荧光探针技术经过不断地发展和完善,在生化分析领域得到了广泛地应用,但是其具有的灵敏度与选择性有限、耐光漂白能力差、进入细胞效率低、细胞或组织自身荧光干扰大以及组织穿透深度小等缺点在很大程度上限制了荧光探针在生物体内的应用。为了更好地满足生物分析实际应用的需求,发展性质优良的荧光探针仍然是科学研究的热点。近年来,各种新型纳米材料及新荧光技术为解决上述问题提供了可能。其中,功能核酸的出现,为提高荧光探针的灵敏度、选择性提供了新的途径。由于其合成和修饰简单、与靶标结合力强、选择性好、生物相容性好等优点被广泛应用于分析检测。功能核酸主要包括两大类能够与目标分子特异性结合的核酸分子,分别是具有类似蛋白酶催化活性、高度依赖辅因子的脱氧核酶（DNAzyme）和具有与抗体性质类似、能与目标分子特异性结合的核酸适配体（Aptamer）。此外,发光硅纳米颗粒、量子点、上转换颗粒等发光纳米材料,由于其发光性能好、细胞穿透能力强、稳定性好、易修饰等优点,可以作为荧光探针信号基团用于生物检测,也可以作为载体用于药物或成像试剂的输送。另外,为了解决传统荧光探针易光漂白、生物组织穿透深度浅及生物自发荧光干扰大等问题,新兴的双光子荧光成像技术利用低能量的近红外光作为激发光源,不仅可以减小激发光对荧光物质的光漂白作用,而且可提高激发光对生物样品的穿透深度,能够实现深层组织中的检测和成像,并且能有效地避免生物样品自发荧光的干扰,在复杂生物样品分析及活体成像中具有广泛的应用前景。本论文利用功能核酸及发光纳米材料的特点,结合双光子荧光成像技术的优势,构建了一系列新型的灵敏度高、选择性好的荧光纳米探针,并成功将其应用于与生命活动密切相关的离子、小分子等目标物的定量检测。具体内容如下:（1）在第2章中,我们利用T4DNA连接酶对ATP的高度依赖性和E.Coli DNA连接酶对NAD⁺的高度依赖性,选用链霉亲和素-生物素复合物作为质量放大器,分别构建了选择性好、灵敏度高的荧光各向异性分析法探针。所得荧光探针能有效地区分ATP和其类似物（AMP和ADP）,或者NAD⁺和其类似物（NADH）,其检测限分别是50 n M和10 n M,均低于类似方法的文献报道值。（2）在第3章中,我们利用脱氧核酶的识别和信号放大功能,结合银纳米簇的优良光学特性,开发了非标记的荧光探针分别用于铅离子以及L-组氨酸的检测。脱氧核酶对其辅因子具有非常高的依赖性和选择性,能特异性地识别并结合目标分子,激活酶活性。激活后的脱氧核酶将底物链切割成两部分后,释放出来的富G部分结合作为荧光信号报告基团的银纳米簇,使荧光得到增强。同时,脱氧核酶的循环作用实现了信号放大,大大提高了对Pb²⁺以及L-组氨酸的检测灵敏度。（3）基于双光子成像技术激发光源组织穿透深度大、对样品损伤小、背景荧光干扰小等优点,在第4章中,我们合成了对HOCl特异性响应的双光子金纳米簇（Au NCs）,并提出了一种具有高选择性、高灵敏度的比率型双光子荧光纳米探针用于细胞中HOCl的检测。双光子内参的设计,有效消除了环境因素的干扰,提高了探针对HOCl检测的准确性。（4）第5章中我们结合双光子纳米颗粒（TPNPs）和CoOOH纳米片,成功构建了双光子荧光纳米探针（TPNPs@CoOOH）用于细胞中抗坏血酸的高灵敏度检测。该双光子纳米粒子表现出对抗坏血酸（AA）的高灵敏度,检测限（LOD）可达170 n M。其优良的细胞膜穿透性和良好的生物相容性有利于深层组织中AA的双光子荧光成像研究。（5）在第6章中,利用人血清白蛋白在癌细胞表面富集的被动靶向作用,我们设计了一种可对耐药性癌细胞进行基因治疗和化疗的多功能纳米颗粒。该纳米颗粒携带的三种DNA能有效抑制耐药性癌细胞中MRP1 m RNA,MDR1 m RNA,Bcl2 m RNA的表达,降低细胞内P-糖蛋白的含量并调控耐药性细胞的凋亡。同时,纳米颗粒的负载作用可减少Dox进入细胞后被P-糖蛋白泵出的几率,提高有效治疗时间。细胞毒性实验证明,该纳米药物运载体系的协同治疗作用能有效地抑制耐药性癌细胞MCF-7/ADR的增殖。