肝移植（liver transplantation，LT）是目前治疗终末期肝病（end stage liver disease，ESLD）的有效手段。在我国，乙肝病毒（hepatitis B virus，HBV）相关肝病已成为肝移植的主要适应症。但是肝移植术后，即使在使用拉米夫定（Lamivudine，LAM）和乙肝免疫球蛋白的情况下，仍有较高的HBV再感染率和乙肝（hepatitis B，HB）复发率，严重影响了肝移植的中远期效果。本课题从研究乙肝病毒相关肝病肝移植术后的免疫-造血系统乙肝病毒库入手，揭示肝移植术后HBV再感染/HB复发的可能机制。在第一部分，我们建立了一种灵敏可靠的检测HBV共价闭合环状DNA（covalently closed circular DNA，cccDNA）的实时荧光定量聚合酶链式反应方法，为后继的研究打下了基础。在第二部分，我们利用密度梯度离心和免疫磁珠分离法获得骨髓造血干祖细胞和外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）、T细胞、B细胞和单核细胞（monocyte，MNC），分别检测总HBV DNA和HBV cccDNA，证实了细胞内仍存在HBV，但未发现有复制的证据。在第三部分，我们利用特异性的HBV-Alu-PCR方法检测PBMC和骨髓造血干祖细胞内HBV X基因的整合情况，发现上述细胞内无HBV X基因的整合，证实HBV相关肝病肝移植受体术后的外周免疫细胞和骨髓造血干祖细胞不是HBV整合的适宜场所。第一部分酶辅助Taq man探针法实时荧光定量PCR检测HBV共价闭合环状DNA方法的建立目的：建立灵敏可靠的实时荧光定量PCR方法，进行HBV cccDNA的检测。方法：利用HBV松弛环状DNA（relaxed circular DNA，rcDNA）和cccDNA结构上的差异，参考现有文献，合成两对针对HBV cccDNA的引物，在有或者无绿豆核酸酶（Mung Bean Nuclease，MBN）辅助的情况下，利用不同浓度的从Dane颗粒中提取的HBV rcDNA和含HBV adr₄亚型全基因组的pBHB4质粒为模板，通过预实验选择最佳引物并确定MBN的最适用量，建立用于检测HBV cccDNA的酶辅助实时荧光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，RT-FQ PCR）方法。结果：1．两对引物均可扩增cccDNA，也可扩增较高浓度的HBV rcDNA，即对HBV cccDNA的扩增仅具有相对特异性；2．MBN可特异性降解HBV rcDNA的单链部分，提高HBV cccDNA引物的特异性，其最适用量为5.0IU；3．跨越HBV rcDNA双链上两个缺口的引物对HBVcccDNA的特异性高于仅跨越一个缺口的引物；4．在MBN辅助下，利用跨越HBV rcDNA双链两个缺口的引物，建立了检测HBV cccDNA的Taq man探针RT-FQ PCR方法，其检测限为5.00×10²～5.00×10⁸copies/ml。结论：用于HBV cccDNA检测的酶辅助RT-FQ PCR方法成功建立，灵敏度高，特异性好，能满足研究的需要。第二部分HBV相关肝病肝移植受体术后外周免疫细胞与骨髓CD₃₄⁺细胞总HBV DNA及HBV cccDNA的检测与临床意义分析目的：了解HBV相关肝病肝移植受体术后，在持续规范拉米夫定联合乙肝免疫球蛋白抗病毒治疗下，外周免疫细胞与骨髓造血干祖细胞内HBV含量及其复制状态，分析其临床意义。方法：25例肝移植受体（男22，女3）术后均应用拉米夫定联合小剂量乙肝免疫球蛋白抗病毒治疗。单用FK₅₀₆抗排异者12例，单用CsA抗排异者13例。平均术后时间为33.32±14.81月（11～77月），平均年龄为45.88±8.71岁（36～64岁）。术前非活跃复制者7例；HBV活跃复制者18例，其血清HBV DNA平均滴度为10^5.954±1.457copies/ml（5.23×10³～8.26×10⁷copies/ml）。采集25例HBV相关肝病肝移植受体的外周静脉血及其中23例的骨髓血，以密度梯度离心结合单克隆免疫磁珠分离法获取单个核细胞、单核细胞、T细胞、B细胞和骨髓造血干祖细胞(CD₃₄⁺细胞)，提取细胞内DNA，以实时荧光定量PCR分别检测各种细胞内总HBV DNA和HBV cccDNA。同时采集血样检测血清HBV DNA定量、乙肝表面抗体浓度、乙肝标志物、血药浓度。结果：25例Anti-HBs均为阳性，平均全血表面抗体浓度为119.1±90.7IU/L；所有受体的血清HBV抗原成分均为阴性：Anti-HBe和Anti-HBc都阳性者5例，Anti-HBe和Anti-HBc都阴性者6例；Anti-HBe阳性而Anti-HBc阴性者1例；Anti-HBe阴性而Anti-HBc阳性者13例。所有受体血清HBV DNA阴性。25例受体的PBMC、MNC（第9和第17例除外）、B（第8例除外）、T、CD₃₄⁺细胞内总HBV DNA均呈阳性，平均浓度分别为10^{3.3263±0.6956}、10^{2.9425±0.6462}、10^{2.7213±0.6223}、10^{2.9522±0.9319}和10^{3.3373±0.6583}copies/10⁶cells。方差分析表明不同细胞内HBV DAN含量有差异（F=3.302，P=0.013），多因素分析表明主要的外周免疫细胞T细胞、B细胞和MNC内的HBV DNA含量与不完全相同的因素相关。所有细胞内及血清内均未检测到HBV cccDNA。结论：HBV相关肝病肝移植术后，即使在较长的术后时间以及规范的抗病毒治疗之下，外周免疫细胞及骨髓造血干祖细胞(CD₃₄⁺细胞)内均有HBV DNA低浓度存在，且受不全相同的因素影响。虽然未检测到细胞内HBV cccDNA，但外周免疫细胞与骨髓造血干祖细胞内的HBV DNA均持续阳性，不能排除外周免疫细胞和骨髓造血干祖细胞仍存在极低水平的HBV复制。在此情况下，不主张中止术后的抗病毒治疗。免疫细胞内HBV含量与免疫功能的关系也待深入研究。第三部分利用HBV-Alu-PCR检测HBV相关肝病肝移植受体术后外周血单个核细胞与骨髓造血干祖细胞(CD₃₄⁺细胞)HBV X基因整合状态目的：了解HBV X基因在HBV相关肝病肝移植受体术后外周免疫细胞和骨髓CD₃₄⁺细胞内的整合情况及其对PBMC内HBV长期维持阳性的意义。方法：病例选择及其基本临床资料同第二部分。获得其PBMC及骨髓CD₃₄⁺细胞后，提取细胞DNA。因X基因的整合频率最高，设计HBV X基因的特异引物，利用HBV-Alu-PCR方法进行三轮半巢式PCR，终产物进行电泳并回收、连接载体、筛选扩增后测序，检测有无X基因整合。结果：经PCR后电泳及测序分析，25例HBV相关肝病肝移植受体术后的PBMC内未检测出HBV X基因的整合，其中采集到骨髓标本的23例CD₃₄⁺细胞中亦未检测到HBV X基因的整合。结论：肝移植术后受体体内HBV微生态的剧烈改变，使HBV整合的基本条件丧失，在此情况下，外周免疫细胞及骨髓造血干祖细胞不是发生HBV整合的适宜场所。