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目的乳腺癌是目前女性最常见的恶性肿瘤之一。晚期可累及骨髓及脾脏,影响造血干细胞的分化。造血干细胞具有无限的增殖及分化潜能,它可分化为红系祖细胞、粒-单核系祖细胞、淋巴细胞系及巨核细胞系。淋巴细胞系、粒-单核细胞系是极为重要的炎症介质细胞,在调节免疫系统中起着重要的作用;而红系祖细胞可分化为原红细胞、早幼红细胞、网织红细胞、成熟红细胞等,对调节体内造血功能起着不可替代的作用。因此,目前临床采用造血干细胞移植治疗血液系统恶性肿瘤和部分实体瘤。课题组前期研究发现,肿瘤的发生发展诱导造血干细胞分化异常,最终导致荷瘤小鼠出现血栓形成和急性贫血,而三七能改善造血细胞分化异常。故本课题研究不同三七皂苷及其苷元对肿瘤相关造血干细胞分化的影响。方法1.第一部分:选取健康BALB/c小鼠48只,分为8组。除正常组外,在其余所有小鼠乳腺脂肪垫处注射100万4T1-Luc细胞悬液,制备小鼠4T1乳腺癌荷瘤模型。分别给予模型组(0.9%生理盐水 0.2ml/只)、PNS(20mg/kg)、PDS(20mg/kg)、PTS(20mg/kg)、CTX(30mg/kg)、G-CSF(30μg/kg)、EPO(60U/kg)。连续腹腔注射给药 25 天,CTX隔天给一次,连续25天。给药后每5天测量一次肿瘤体积,每5天检测体重;给药3周后,活体荧光成像检测肿瘤生长及转移情况。末次给药2h后,取外周血,剖取原位瘤、肺、胸腺及脾脏,计算各脏器指数;取肺,10%福尔马林灌注固定48h后记录肺部转移灶数目;固定脾脏、肿瘤组织进行苏木素-伊红(H&E)染色,观察组织病理变化;免疫组织化学(IHC)法,观察分析脾脏组织CD61、MPO的阳性表达情况。血常规检测外周血象的变化情况。分离小鼠骨髓及脾脏细胞,用CD71和Ter119抗体、CD34、CD115、CD4和CD8、CD11b和Gr-1抗体与各组小鼠骨髓细胞、脾细胞分别共孵育,流式细胞仪检测三七皂苷对4T1转移性乳腺癌荷瘤小鼠红系及髓系细胞分布的影响。2.第二部分:三七中皂苷成分种类繁多,包括三七皂苷R1、R2、R3、R4、R5、R6和人参皂苷Ra、Rb、Rd、Re、Rg1等多种单体皂苷成分。这些皂苷类成分在体内水解失去全部配体糖链后,最终代谢为皂苷元PPT、PPD等,故第二部分我们研究PPD、PPT对荷瘤小鼠脾脏细胞体外分化的作用。体外培养BALB/c小鼠脾脏细胞,XTT法检测不同浓度下PPD、PPT对细胞存活率的影响;体外培养4T1转移性乳腺癌荷瘤小鼠脾细胞,给予不同浓度的PPD、PPT,通过RT-PCR检测细胞PU.1、GATA-1、GATA-2、EBP/α、GM-CSF mRNA表达水平。荷瘤小鼠脾细胞与不同浓度的PPD、PPT在甲基纤维素半固体培养基上原代培养,一定时间后在显微镜下观察BFU-E、CFU-GM、CFU-M集落形成的数目。用 CD71 和 Ter119、CD34、CD115、CD4和 CD8、CD11b 和 Gr-1 流式抗体分别标记处理后的小鼠脾细胞,检测PPD和PPT对4T1转移性乳腺癌荷瘤小鼠脾造血干细胞红系及髓系分化的影响。细胞免疫化学法检测PPD和PPT处理后4T1细胞EPO、G-CSF的表达程度。结果 第一部分:PDS组在给药后第10天体重开始下降,差异有统计学意义(P<0.01～0.05),PTS组与PNS组分别在给药第15天、20天体重有所下降,差异有统计学意义(P<0.05);PDS组从接种第25天后,肿瘤体积小于模型组,差异有统计学意义(P<0.05);PDS组小鼠的肿瘤指数较低,肺脏指数较高,差异有统计学意义(P<0.05);荧光活体成像结果显示PTS组、PNS组发光强度比模型组低。血常规结果中PDS组RBC、HGB、HCT、NEUT%降低,LYMPH%、EO%升高(P<0.05),NLR与转移率成正相关;外周血涂片显示乳腺癌荷瘤小鼠的单核细胞、淋巴细胞增多,而红细胞减少,PTS、PDS、PNS组中性粒细胞减少;HE染色结果显示PTS组小鼠胸腺细胞结构明显较模型组规则,有明显的明区暗区之分,可见密集的小淋巴细胞团;PDS组亦可见淋巴细胞增多。PDS、PTS 处理后小鼠骨髓细胞中 CD34+、CD11b+/Gr-1+、CD71+/Ter119+、CD4+/CD8+细胞比例升高,CD115+、CD11b+/Gr-1-比例均降低;脾脏细胞中CD34+、CD11b+/Gr-1+比例升高,CD71+/Ter119+、CD4+/CD8+、CD115+、CD11b+/Gr-1-比例均降低。脾脏 IHC 结果显示:PDS、PTS、PNS给药组MPO阳性表达均较模型组降低。PDS、PTS组CD61阳性细胞表达率较模型组降低。第二部分:通过XTT检测,PPD 10μM或更低浓度对小鼠脾脏细胞无明显抑制增殖作用,PPT 30μM或更低浓度对小鼠脾脏细胞无明显抑制增殖作用。PPT 10μM、1μM、0.1μM、PPD 10μM、1μM均能抑制粒细胞-巨噬细胞集落形成,PPD抑制红细胞爆裂型集落生成(P<0.01),PPT与PPD均抑制巨噬细胞集落形成。PPD、PPT给药组脾脏细胞CD11b+/Gr-1-、CD71+/Ter119+细胞比例均减少,其中PPD10μM、PPT10μM 组 CD11b+/Gr-1-细胞比例显著减少(P<0.01～0.05),PPT 10μM、PPT 1μM、PPD 10μM组CD11b+/Gr-1+比例均降低,但差异无统计学意义。PPD、PPT给药组 GATA-1、GATA-2、GM-CSF、PU.1、C/EBPα 的 mRNA 表达量均降低。经 PPD、PPT诱导后EPO、G-CSF阳性表达均较对照组减弱。结论1.三七二醇型皂苷PDS具有一定抗乳腺癌作用,可能与其调节造血干细胞分化,从而影响血细胞分布有关。2.三七皂苷可增加骨髓中造血干细胞及红系祖细胞的比例,促进荷瘤小鼠的造血能力。3.PDS不改善肿瘤诱导的贫血现象,但是可以通过降低NLR调节肿瘤免疫环境,PDS的这个作用可能与PDS降低荷瘤小鼠脾脏系数,增加胸腺系数有关。4.PPD、PPT抑制脾脏细胞红系分化可能与其降低肿瘤EPO的分泌从而降低GATA-1与GATA-2的表达有关。5.PPD、PPT抑制脾脏细胞粒-单核系分化可能与其降低肿瘤G-CSF的分泌从而降低PU.1与C/EBPα的表达有关。