水稻白叶枯病是一种由白叶枯病菌引起的细菌性病害,已严重影响到了水稻的品质与产量。克隆抗病基因,培育抗病品种才是经济有效的防治水稻白叶枯病方法。本研究克隆了22个水稻抗白叶枯病相关基因。其中4个基因是通过酵母双杂筛选出的抗病相关基因,另外18个基因是对Y73接种白叶枯病菌后筛选出的抗病相关基因。Xa5是水稻感病抗病过程中的一个重要信号转导节点；xa5是一个己知的抗病基因,它的抗病功能是由于其编码的蛋白与Xa5有一个氨基酸的差异；OmXa5是疣粒野生稻中Xa5的等位基因,而且它编码的蛋白与Xa5、xa5均有差异。为了研究这22个基因的功能及它们与水稻抗白叶枯关键基因Xa5、xa5、OmXa5之间的互作关系,我们进行了一系列的研究。22个互作候选基因分别与Xa5、xa5、OmXa5进行BiFC(双分子荧光互补)互作鉴定后发现：Xa5与过氧化氢同工酶(Os02g0115700)、类组蛋白(Os05g0461400)互作发生在细胞核上,与类泛素蛋白(Os09g0420800)互作同时发生在细胞核和细胞质膜上,与其余的19个候选基因互作时没有观察到荧光信号；OmXa5与这22个候选基因的互作模式和Xa5相同；xa5与过氧化氢同工酶(Os02g0115700)、类组蛋白(Os05g0461400)互作发生在细胞核上,与类泛素蛋白(Os09g0420800)和其余19个候选基因互作时没有观察到荧光信号,可见xa5与这22个候选基因的互作模式与Xa5不同。我们推测类泛素蛋白(Os09g0420800)、过氧化氢同工酶(Os02g0115700)、类组蛋白(Os05g0461400)这三个蛋白可能是水稻抗病相关途径中的重要调控因子；OmXa5的功能与Xa5相似,其突变的氨基酸可能对蛋白的功能无影响。利用亚细胞定位技术对22个互作候选基因的表达产物进行了分析,为这些基因的功能研究提供了重要信息。22个候选基因中5个基因的sGFP融合蛋白定位于细胞核上,可能发挥了转录因子的功能；5个基因的sGFP融合蛋白定位于细胞质膜上,推测其功能可能是在细胞质膜上调控物质转运；6个基因的sGFP融合蛋白同时定位于细胞核和细胞质膜上；另外还有6个基因的sGFP融合产物亚细胞定位时没有观察到荧光定位信号。在进行互作鉴定及亚细胞定位观察时,我们采用的是快速灵活的Gateway重组技术。但在构建入门载体时较低的线性化效率和连接效应影响了实验的进展。于是我们对现有的入门载体构建系统进行改进,用内切酶BciⅥ来线性化入门载体。BciⅥ线性化载体的效率要远远高于XcmⅠ,且在测试实验中用BciⅥ线性化的T载体连接基因片段后阳性克隆数也比XcmⅠ多出大约40%。长度在2000 bp内的PCR片段都可以高效的连接到BciⅥ线性化后的T载体(大约50%的克隆中目的基因片段都以期望的方向连入了入门载体)。随着片段长度的增加克隆数和克隆阳性率虽有下降,但最大仍可连入长度为4700 bp的基因片段。改进后的入门载体构建方法具有稳定高效的特点,将来可以用来更加高效的构建Gateway入门载体。