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在本课题的研究中我们构建了一系列条件复制性腺病毒载体,其主要特征是删除了 5 型腺病毒 E1 区基因,代之以经过结构优化的甲胎蛋白启动子基因,在其上游插入基因调节序列 HS4,在其下游插入腺病毒的 E1A 基因、报告基因 AP或治疗基因 TRAIL,这些插入的外源基因的表达由隔离子和甲胎蛋白启动子共同调控。通过这一系列的重组腺病毒载体,研究 E1A 基因在溶瘤性腺病毒载体中的作用,研究由甲胎蛋白启动子调控的溶瘤性腺病毒载体对表达甲胎蛋白的原发性肝癌细胞的特异性杀伤作用,研究上游调控基因对外源启动子的特异性及启动活性的调控作用,研究由肿瘤特异性的溶瘤性腺病毒载体表达治疗性基因对肿瘤细胞的特异性治疗作用。 为研究 E1A 基因在溶瘤性腺病毒载体中的作用,我们构建了 Ad.IR-AP 载体和 Ad.IR-AP/E1A 病毒,体外细胞试验表明,E1A 的表达可以促进 Ad.IR-AP/E1A腺病毒载体在体外培养细胞中的复制以及对肿瘤细胞的致细胞病变作用。将Ad.IR-AP/E1A 病毒通过静脉给药方式注射入荷瘤动物体内,结果显示 E1A 基因的表达可以有效的促进腺病毒载体在肿瘤细胞中的复制与病毒在肿瘤细胞间的播散。 为研究甲胎蛋白启动子调控的腺病毒载体在分泌甲胎蛋白的原发性肝癌细胞中特异性表达目标基因,以及基因调节序列隔离子 HS4 序列对甲胎蛋白启动子特异性的调控,我们构建了 Ad.AFP-AP 和 Ad.HS4.AFP-AP 病毒载体。结果表明,在表达甲胎蛋白的原发性肝癌细胞中,由 AFP 启动子调控的腺病毒特异性的表达报告基因 AP,而在 AFP 启动子之前插入隔离子 HS4 序列可以增强重组病毒针对表达甲胎蛋白的原发性肝癌的特异性。 结合以上研究结果,我们构建了具有治疗用意义的重组溶瘤腺病毒载体Ad.HS4.AFP.E1A/TRAIL, 利用特异性针对表达甲胎蛋白的原发性肝癌细胞的溶瘤腺病毒载体表达治疗基因 TRAIL,以达到增强治疗原发性肝癌的特异性及有效性的目的。研究结果表明,Ad.HS4.AFP.E1A/TRAIL 溶瘤病毒具有针对表达甲胎蛋白的原发性肝癌的特异性,在体外细胞及动物体内肿瘤模型中都可以特异性杀伤肿瘤细胞。 本研究探索了利用异源的肿瘤特异性启动子结合隔离子等基因转录调控元 4<WP=5>件调控溶瘤性腺病毒载体,在靶向组织中特异性复制病毒与表达插入的外源基因,为肿瘤基因治疗探索一种新的手段。