研究背景及研究意义：　　 全变态昆虫的一生要经历多次蜕皮，包括幼虫各龄期之间的蜕皮、末龄幼虫到蛹的变态蜕皮、以及蛹到成虫的羽化蜕皮。昆虫蜕皮和变态主要受两种激素的调控:蜕皮激素(20-hydroxyecdysone，20E)和保幼激素(Juvenilehormone，JH)。这两种激素相互作用，共同决定着昆虫不同发育阶段生理活动和形态变化。在没有JH存在的情况下，20E启动变态过程。在变态过程中，幼虫的组织发生降解，而成虫的组织逐渐形成。在幼虫组织降解过程中发现了血细胞的参与，但血细胞如何影响组织降解却并不清楚。阐明血细胞与变态期幼虫组织水解的关系，并探索血细胞中特异表达的蛋白cathepsinL的功能，可以阐明血细胞在变态期组织重建中的作用及机理。　　 研究进展：　　 昆虫的血细胞被认为主要参与免疫反应，包括在病原微生物周围形成包囊和结节以及吞噬病原微生物，清除外源物质，然而也有报道表明血细胞可以在昆虫的生长发育以及变态过程的组织重建中发挥重要作用。我们实验室前期研究也发现组织蛋白酶L在血细胞中特异表达，并在变态时期高表达，受蜕皮激素上调。在棉铃虫幼虫进行RNA干扰沉默cathepsinL之后，导致循环的颗粒细胞减少，脂肪体中没有颗粒细胞进入而不能降解，形成不正常的嵌合蛹，提示20E促进cathepsinL在血细胞中表达从而参与组织解体。　　 存在的科学问题：　　 虽然前人研究已经发现了20E促进cathepsinL表达，决定颗粒细胞数量、进而决定脂肪体降解，但cathepsinL在颗粒细胞中的功能及作用机理不清楚，干扰cathepsinL导致颗粒细胞减少的原因尚不清楚，血细胞进入脂肪体以及在脂肪体解体中的作用机理也需要进一步实验证据。　　 研究结果：　　 针对存在的科学问题，本论文运用分子生物学和细胞生物学技术开展研究，取得如下结果：　　 1.通过细胞形态观察，发现血细胞在变态过程中会发生明显变化，主要表现为颗粒细胞数量增加，体积增大，且所含颗粒数目增多，转变为大颗粒细胞。与此同时，浆血细胞的数量急剧减少。　　 2.利用Westernblot检测发现cathepsinL在蜕皮变态过程中表达量显著增加。免疫细胞化学结果显示cathepsinL主要定位于颗粒细胞和浆血细胞的细胞质中。　　 3.通过血细胞进体外培养的方法，证明20E可以促进浆血细胞的铺展，促进颗粒细胞转变为大颗粒细胞并迁移粘附到铺展的浆血细胞上。Westernblot显示20E同时使cathepsinL上调表达。　　 4.运用RNAi在体外培养的血细胞中干扰cathepsinL，导致大多数颗粒细胞漂浮死亡在培养液中，不能形成大颗粒细胞。同时浆血细胞的铺展也受到了抑制。　　 5.通过活细胞荧光标记血细胞后重新注射到虫体内，证明血细胞可以进入变态期的幼虫脂肪体中，使脂肪体降解和水解。　　 6.通过在棉铃虫表皮细胞系中过表达cathepsinL的蛋白酶功能域，发现其过表达可导致细胞凋亡，说明cathepsinL可通过蛋白酶活性参与脂肪体降解。　　 7.变态时期血细胞凋亡率明显增加，且凋亡细胞主要为颗粒细胞。　　 8.CathepsinL可以在6th-96h和6th-120h幼虫的血浆和脂肪体中检测到，说明凋亡细胞可能将cathepsinL释放到血浆中，并参与脂肪体的降解。　　 结论及意义：　　 本研究证明了棉铃虫颗粒细胞在变态时期数量增加并转变为大颗粒细胞;cathepsinL在变态期高表达，主要分布在颗粒细胞及浆血细胞中;20E促进cathepsinL表达和颗粒细胞的形态转化;干扰cathepsinL之后导致20E激素不能促进颗粒细胞转变为大颗粒细胞而死亡;变态时期的血细胞可以进入到幼虫脂肪体中;棉铃虫表皮细胞系中过表达cathepsinL可以引起细胞凋亡;变态时期血细胞凋亡率增加，;凋亡的血细胞可以释放cathepsinL到血浆中参与组织的降解。　　 本研究阐明了血细胞在昆虫变态过程的组织重建中发挥作用，其作用机理是20E调控cathepsinL表达，促进颗粒细胞形态转化并进入脂肪体，同时cathepsinL还可以引起血细胞的凋亡，并释放到血浆中，参与脂肪体降解。