论文部分内容阅读
研究背景:动脉粥样硬化（As）是一个复杂的病理生理过程,目前认为其发病主要与血浆中脂蛋白水平升高,动脉内膜损伤导致动脉壁通透性增加以及脂蛋白穿过单层内皮细胞在内膜下沉积有关。临床研究发现,氧化脂蛋白（a）（oxLp（a））在As斑块中广泛存在,其中破裂斑块尤其突出,并且与泡沫细胞共存,这提示了oxLp（a）与As的发生发展密切相关。血管内皮在维持血管的正常形态和功能中起重要作用,血管内皮是由单层内皮细胞紧密连接而成,因此细胞与细胞之间的连接至关重要,而桥粒连接是最主要的血管内皮的连接方式。桥粒芯糖蛋白-1（DSG1）和桥粒芯胶蛋白-2（DSC2）属于桥粒钙粘素蛋白家族成员,参与了血管壁生理屏障的构成,维持细胞与细胞之间的完整性,因此细胞与细胞之间的这种桥粒连接在调控单层内皮细胞的通透性上起着非常重要的作用。本研究旨在探讨oxLp（a）对人脐静脉内皮细胞DSG1和DSC2表达的影响,以及由此导致的内皮细胞通透性的改变,以及活性氧（ROS）在其中的作用。实验一:oxLp（a）对人脐静脉内皮细胞DSG1,DSC2表达的影响目的:观察oxLp（a）对人脐静脉内皮细胞上跨膜蛋白DSG1和DSC2表达的影响。方法:待细胞生长融合后,每次实验前6h给HUVECs换上新鲜的无血清培养基以获得同步化生长,6h后再换上新鲜的培养基并加入不同浓度的oxLp（a）（0mg/L,25 mg/L,50 mg/L,100 mg/L）处理HUVECs24h,检测不同浓度的oxLp（a）对HUVECs上DSG1,DSC2 mRNA以及蛋白表达的影响;再用100 mg/L oxLp（a）分别处理HUVECs不同时间（0h,6h,12h,24h）,用RT-PCR和Western blotting分别检测DSG1,DSC2 mRNA以及蛋白的表达。结果:oxLp（a）浓度依赖性地下调HUVECs上DSG1,DSC2 mRNA以及蛋白的表达,oxLp（a）在25 mg/L时即有显著作用（P<0.05）,且随着oxLp（a）浓度的升高,DSG1、DSC2 mRNA和蛋白表达水平呈浓度依赖的下降趋势,100 mg/L组与0mg/L相比,DSG1、DSC2 mRNA和蛋白的表达下调最明显（P<0.05）;100 mg/L oxLp（a）在孵育6h即能显著下调DSG1,DSC2 mRNA以及蛋白的表达（P<0.05）,且随着处理时间的延长,DSG1、DSC2 mRNA和蛋白表达水平呈时间依赖的下降趋势,24h组与0h组比较,DSG1、DSC2 mRNA和蛋白的表达下调最明显（P<0.05）。实验二:ROS参与oxLp（a）对HUVECs DSG1,DSC2表达的调节目的:观察oxLp（a）是否通过促进细胞内活性氧的生成来调节HUVECs上DSG1,DSC2的表达。方法:用100 mg/L Lp（a）、100 mg/L oxLp（a）、100 mg/L BSA、200μmol/L H2O2分别与HUVECs孵育24h,空白组作为对照,用RT-PCR和Western blotting分别检测DSG1,DSC2 mRNA以及蛋白的表达情况。用100 mg/L oxLp（a）、100 mg/LSOD预孵育1h后再加入100 mg/L oxLp（a）、100 mg/LSOD分别处理HUVECs24h,空白组作为对照,用DCFH-DA荧光探针检测细胞内ROS的生成情况;用RT-PCR和Western blotting分别检测DSG1,DSC2 mRNA以及蛋白的表达。结果:oxLp（a）、H2O2显著下调HUVECs DSG1,DSC2 mRNA以及蛋白的表达（P<0.05）,而Lp（a）、BSA对其无明显影响（P>0.05）。oxLp（a）组与空白对照组相比,细胞内活性氧的生成明显增多,用SOD预孵育后,活性氧的产生有所降低,而SOD组与对照组相比无明显差别;oxLp（a）抑制DSG1,DSC2 mRNA以及蛋白的表达（P<0.05）,而用SOD预孵育后,这种抑制作用得到了改善,SOD组与对照组相比无明显差别,这与活性氧的测定结果是相一致的。实验三:oxLp（a）对单层内皮细胞通透性的影响目的:观察oxLp（a）对单层内皮细胞通透性的影响。方法:用100 mg/L oxLp（a）处理HUVECs24h后,在上室加入FITC-dextran,分别在不同的时间点（0h,0.25h,0.5h,1h,2h,4h）收集下室中的液体,测量液体的荧光强度,确定测量通透性的最佳时间。用不同浓度的oxLp（a（）0mg/L,25 mg/L,50 mg/L,100 mg/L）分别或者与SOD共同孵育HUVECs 24h后,在上室中加入FITC- dextran与孵育2h,空白组作为对照,取下室中的液体用荧光分光光度计测定荧光强度,代表通透性改变。结果:oxLp（a）处理细胞24h后,在上室中加入FITC-dextran,不同时间点收集下室中的液体测量荧光强度,结果显示,在2h时荧光强度最强,4h与2h相比无显著差异（P>0.05）,说明2h是测量通透性的最佳时间;oxLp（a）也以剂量依赖性的方式增加单层内皮细胞的通透性,在25 mg/L时即有作用（P<0.05）,随着oxLp（a）浓度的升高,单层内皮细胞的通透性也逐渐增加,100 mg/L时作用最明显（P<0.05）;100 mg/L oxLp（a）所致的单层内皮细胞通透性的增加能够被SOD所抑制（P<0.05）。结论:oxLp（a）以剂量和时间依赖性方式下调HUVECs上DSG1,DSC2的表达,并增加单层内皮细胞的通透性;活性氧生成增加与oxLp（a）致DSG1,DSC2表达的下调以及单层内皮细胞通透性的上升有关。