RhoA是重要的细胞内信号转导分子,属于小G蛋白(small G protein)家族Rho GTP酶(Rho GTPase)亚家族成员。Rho GTP酶是一类核苷酸依赖型蛋白,在细胞信号转导过程中发挥着“分子开关”的作用。其具有两种结合状态,一种是与三磷酸鸟苷(Guanosine triphosphate,GTP)结合的活化状态,另一种是与二磷酸鸟苷(Guanosine diphosphate,GDP)结合的非活化状态。在活化状态时,Rho-GTP能识别靶蛋白,产生应答反应直至水解转变为非活化状态的Rho-GDP。在生物体内,Rho GTP酶通过在活化型GTP(Rho-GTP)与非活化型GDP(Rho-GDP)构象间循环,从而控制复杂的细胞生理过程。迄今Rho GTP酶亚家族已发现有20多个,如RhoA、Rac1、CDC42等,其中尤以RhoA的研究最为活跃。RhoA等Rho GTP酶广泛分布于哺乳动物细胞中,在胞内信号转导中发挥桥梁作用,是多条信号通路的关键分子,已成为新药开发的靶标。Rho GTP酶通过在活化型(Rho-GTP)与非活化型(Rho-GDP)构象间循环来传导胞内信号,在调节细胞骨架组织、黏附、迁移、增值以及生存方面具有重要的作用。Rho GTP酶在对T细胞的极化方面以及对胸腺细胞的生成具有举足轻重的作用。过敏性气道炎症是一种慢性变态反应性气道炎症,T细胞在其发病机制中起着基础型作用。因此,可尝试通过研究RhoA相关信号通路以探索更新更有效的治疗过敏性气道炎症方法。感染日本血吸虫后,沉积在肝脏内的虫卵引起的虫卵肉芽肿是血吸虫病患者最为重要的免疫病理损害,肉芽肿的形成主要依赖于Th2型细胞的免疫应答,其分泌的白细胞介素4(IL-4)、白细胞介素5(IL-5)、白细胞介素13(IL-13)对肉芽肿的形成起到非常重要的作用。随着虫卵在肝脏逐渐沉积,Th1型反应受到抑制,可观察到更为明显的Th2型反应,这对于肝脏肉芽肿的形成具有促进作用。已有研究表明RhoA信号通路可以对Th2细胞的分化起到重要的调节作用,RhoA基因的缺失在T细胞活化过程中通过影响其氧化磷酸化和糖酵解反应来抑制Th2细胞分化,从而对肝纤维化起到抑制作用。研究显示,选择性阻断Rho GTP酶信号通路可以抑制纤维化的进展,改善预后。目前,RhoA对肝脏纤维化的调节机制仅限于对Th2细胞的研究,而对Th17细胞及对日本血吸虫引起的肝纤维化中的调节作用研究甚少。ROCK(Rho-associated kinase,Rho相关激酶)是RhoA下游信号通路主要分子之一。其选择性抑制剂法舒地尔(Fasudil)已较广泛地用于RhoA相关功能研究。为探讨RhoA对Th17细胞及在日本血吸虫感染肝纤维化中的调节作用,本研究首先通过体外实验观察法舒地尔对Th17细胞体外分化及细胞因子分泌的作用以及对肝星状细胞凋亡的影响;在此基础上进一步研究法舒地尔治疗对日本血吸虫感染小鼠虫负荷及肝纤维化的调节作用。研究内容主要包括以下几个方面。目的:运用RhoA抑制剂法舒地尔通过体外实验研究其对Th17细胞体外分化及肝星状细胞凋亡的影响。其次通过体内实验,观察法舒地尔的治疗对虫负荷及肝纤维化的影响。最后结合其作用的分子机理,阐明RhoA抑制剂法舒地尔对Th17细胞及日本血吸虫感染及肝纤维化的调节作用。方法:1.CD4~+T细胞的体外极化培养:从小鼠脾脏中纯化得到初始(na?ve)CD4~+T细胞,按照极化条件的不同分为三组:不加细胞因子刺激的中性条件下培养组,加TGF-b(16)细胞因子的刺激组,加TGF-b(16)+IL-6细胞因子的刺激组,体外培养4天。2.法舒地尔刺激培养:将三组CD4~+T细胞与法舒地尔(30mM)共培养4天,培养结束前5 h,通过PMA/Ionomycin再刺激,培养结束后,细胞胞内Th17染色,流式检测,分析法舒地尔对Th17细胞极化的影响。收集培样上清,采用ELISA法测定上清中IL-17F、IL-21效应细胞因子的含量。3.法舒地尔体外对肝星状细胞凋亡的影响:将肝星状细胞在法舒地尔浓度为0mM、5mM、10mM、20mM、50mM条件下培养24 h,观察不同浓度法舒地尔对肝星状细胞凋亡情况的影响。4.建立小鼠日本血吸虫感染模型后,将模型组随机分为三组:法舒地尔0mg/kg、法舒地尔10 mg/kg、法舒地尔30 mg/kg。于感染血吸虫后第三周开始每天腹腔注射用药,直至第八周,并于感染后第四周开始,收集小鼠粪便,称重,制成悬液,显微镜下计数,每份样本计数3次,取均值,计算各组每克粪便虫卵数(eggs per gram,EPG)。分析感染后4周、5周、6周、7周粪便虫卵数动态变化。于第8周处死小鼠,作肝门静脉和肠系膜静脉灌流作成虫计数。5.取肝脏,按其生理分页分别做石蜡切片HE和Masson三色染色、虫卵计数、羟脯氨酸含量测定、实时荧光定量PCR测定(Ⅰ型胶原蛋白(Collagen-Ⅰ,Col-Ⅰ)、Ⅲ型胶原蛋白(Collagen-Ⅲ,Col-Ⅲ)及转化生长因子-b(16)(TGF-b(16)))mRNA表达水平。结果:1.法舒地尔对CD4~+T细胞的体外分化的影响:通过观察初始(na?ve)CD4~+T细胞在Th17极化条件下体外培养,我们发现法舒地尔对Th17细胞的体外分化及相关细胞因子的分泌具有抑制作用。2.在体外培养实验中,法舒地尔能诱导肝星状细胞(Hepatic stellate cells,HSC)的凋亡并呈剂量依赖型关系。3.小鼠感染血吸虫后第4、5、6和7周粪便虫卵数相互比较,差异均无统计学意义(p>0.05);门静脉和肠系膜静脉灌流统计成虫数目,成虫数目间差异无统计学意义(p>0.05);第8周肝脏虫卵负荷,差异无统计学意义(p>0.05)。4.HE染色观察虫卵肉芽肿大小,可见法舒地尔治疗组虫卵肉芽肿面积明显比PBS对照组小(p<0.05)。Masson三色染色结果显示,法舒地尔治疗组肝脏蓝色纤维条索较PBS对照组明显减少(p<0.05),且与羟脯氨酸检测结果一致。与肝纤维化密切相关的基因Col-I、Col-III及TGF-b(16)的mRNA检测结果显示,法舒地尔治疗组较PBS对照组表达量明显降低(p<0.05)。结论:1.RhoA-ROCK选择性抑制剂法舒地尔能显著下调Th17细胞的体外分化及细胞因子的分泌。2.法舒地尔在体外能诱导肝星状细胞的凋亡,并呈剂量依赖型关系。3.运用日本血吸虫实验感染模型,我们发现法舒地尔对感染鼠体内虫负荷及虫卵产生无明显作用,但能明显抑制虫卵肉芽肿生成及肝纤维化,并能下调与肝纤维化相关基因Col-I、Col-III及TGF-b1等mRNA的表达。4.本研究率先运用RhoA-ROCK选择性抑制剂法舒地尔,初步揭示了其对Th17细胞及日本血吸虫感染诱导的肝纤维化的调节作用。本研究为探索通过调控RhoA-Th17轴以开发治疗肝纤维化的新靶点奠定了一定的基础。