一、研究背景经典的巴甫洛夫恐惧记忆条件反射模型(Pavlovian fear conditioning)的建立是通过一个无害的刺激,即条件性刺激(conditioned stimulus, CS),如声音,光线,环境等和一个先天的厌恶性非条件刺激(unconditioned stimulus, US)如足底电击建立条件反射来实现的。条件反射建立稳定之后,如果给予动物反复的CS刺激,又会使得动物觉得偶联的CS无害,导致恐惧记忆渐进性减弱,从而造成记忆的消退(extinction)。但消退不是永久性的,消退的记忆会被一些自发因素再次唤起,这提示消退可能并不是直接对原有记忆的修改,而是通过形成一个新的记忆来抑制原有的记忆的激活。这种对原有记忆的抑制是和消退训练时的时空环境以及动物的感觉紧密相关的,人类和啮齿类动物相似,都会在三种普遍的情况下发生消退后的记忆的再度出现。这三种情况是：(1)更新(renewal),当CS在消退环境外的环境出现时会发生；(2)复原(reinstatement),当原始的US再次出现时发生；(3)自发恢复(spontaneous recovery),当消退后经历一定时间后会出现。当前在临床治疗上,基于消退训练的暴露疗法广泛地应用于许多病态记忆的治疗中,例如创伤后应激综合症、恐惧症等等。这些治疗方法在某些方面是有效的,但是并不适用与任何人,部分患者会由于更新、复原或自发恢复而导致病情的复发。以往的研究表明,记忆的再巩固后会有一个记忆变的不稳定的时间窗。近来的研究表明,将记忆提取(retrieval)出来,并在提取后的时间窗内进行记忆的消退训练有擦除记忆的作用,从而抑制了原有记忆的唤起。也就是说,用之前和足底电击偶联在一起的CS将记忆提取出来(即retrieval),10min或1小时之后进行消退训练,可以有效地擦除恐惧记忆的更新、复原和自发恢复(6小时以后则会失效)。这种记忆提取-消退模型是可以消除原有记忆复发的一个有效模型,而且已经证明这种模型不仅在恐惧记忆中存在,在成瘾记忆中也存在,并且擦除效果在啮齿类和人类身上都有效。然而这种记忆擦除模型具有一定的局限性：有研究报道在记忆巩固完成一个月之后再用Retrieval+Extinction模型就无法擦除记忆；并且这种擦除模型限定条件较多,如果更改模型中的一些条件,则记忆擦除就有可能会失败。因此,找到记忆擦除的机制,并针对介导记忆擦除的关键性位点进行干预,将为我们对相关基本疾病的治疗(如创伤后应激综合症等)的应用大有裨益。突触在动物的学习记忆过程中会发生一系列的形态学和功能上的变化,这些变化是依赖与蛋白合成与蛋白降解的共同作用的。目前针对蛋白合成与学习记忆的关系研究的较为透彻,但对蛋白降解在学习记忆作用却研究很少。真核细胞的蛋白降解是一个动态且复杂的过程,泛素蛋白酶体系统(ubiquitin-proteasome system, UPS)在这个过程中扮演着重要的角色。有研究表明,在伏核核部(nucleus accumbens, NAc)注射蛋白酶体抑制剂可以破坏可卡因奖励记忆的消退,但明确的关于蛋白降解是否参与线索性条件性恐惧记忆中的声音诱导的条件性恐惧记忆模型(Auditory fear conditioning, AFC)的消退还没有报道。此外,最新的研究表明,在环境诱导的条件性恐惧记忆模型中,海马CA1脑区中的多泛素化水平会在记忆提取之后升高。联系之前的研究,我们可以提出假设,是否记忆提取之后蛋白降解水平的升高介导了记忆的擦除过程?在这篇文章中,我们采用声音诱导的条件性恐惧记忆模型研究了记忆擦除的机制。我们发现在大鼠的杏仁体基底外侧核(basolateral amygdala, BLA)中,蛋白酶体系统介导的蛋白降解在记忆擦除中扮演着重要角色。二、研究目的研究蛋白降解在记忆擦除中的作用并初步探讨其机制。三、实验结果1.在BLA注射蛋白酶体活性抑制剂βLac对AFC记忆消退的影响在双侧BLA注射蛋白酶体的抑制剂βLac0.5hr后进行消退训练,24小时后检测LTM,评价其对大鼠AFC记忆消退的影响。与溶剂对照组相比,实验组的Freezing值与对照组无明显差异。2. βLac抑制retrieval对AFC记忆消退自发恢复的擦除所有的动物在经历三次CS-US偶联刺激之后分为三组：retrieval后消退组(Ret组),注射βLac后retrieval并消退组(Ret+βLac组)以及no retrieval消退组(No Ret组)。三组注射溶剂或者βLac30min后进行retrieval或者noretrieval训练,1hr之后对动物进行消退训练,24小时后检测LTM,在LTM测试两周后检测动物的自发恢复情况。结果显示,三组间的LTM和extinction结果均无差异(ANOVA, p>0.1);和Ret组相比,No Ret组和Ret+pLac组自发恢复的freezing值明显升高,并且两组间无差异。这说明retrieval后的蛋白降解是AFC记忆消退自发恢复的擦除所必需的。3. βLac抑制retrieval对AFC记忆消退更新的擦除在做renewal实验时,动物在A环境建立条件反射之后同样分为三组：Ret组、Ret+βLac组以及No Ret组。三组的脑内给药方式及retrieval或者noretrieval方式同上,区别之处在于在B环境进行。三组retrieval或者no retrieval后在B环境做消退训练,24小时后在B环境检测LTM。在LTM测试24小时后,将所有动物放置回A环境检测动物的记忆renewal情况时,我们发现和Ret组相比,No Ret组和Ret+βLac组renewal的freezing值明显升高,并且两组间无差异。4. PLac抑制retrieval对AFC记忆消退复原的擦除对于reinstatement实验,所有的实验都在同一环境下进行。三组的脑内给药方式及retrieval或者no retrieval方式同上。所有的三组动物在经历了相同水平的条件反射建立和消退训练之后,动物再次暴露于相同环境下承受5次US刺激(此过程中无CS出现)。再过24hr之后,通过4次CS刺激检测动物的reinstatement情况时发现与各自的最后四次extinction CS相比,No Ret组和Ret+βLac组的freezing水平都有所增加,而Ret组无变化。5. Retrieval后泛素化介导的蛋白降解增加介导消退记忆的擦除动物分五组：No Retrieval后一小时取材组(No Ret组)；No Retrieval后1小时进行消退训练,训练后立即取材组(NO Ret+Ext组)：Ret rieval后一小时取材组(Ret1hr组)；RetrievaL后1小时进行消退训练,训练后立即取材组(Ret+Ext组)；RetrIevaL后2小时取材组(Ret2hr组)。取材部位为BLA。GST-S5a多泛素化分析实验结果表明,No Ret组与Ret2hr组的多泛素化水平都高；No Ret组与No Ret+Ext组相比多泛素化水平没有明显变化；Ret+Ext组多泛素化水平与No Ret+Ext组有明显升高。四、实验结论我们首次发现蛋白降解在记忆擦除的过程中发挥重要作用；retrieval在记忆擦除的过程中可能起着导火索的作用,使得在BLA中本无蛋白降解参与的消退过程发生了大量的蛋白降解,从而改变了消退训练的结果,最终擦除了原始的恐惧记忆。