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新生血管的生成(血管生成)在成年人损伤愈合和组织生长等过程中起重要作用,在病理情况下,血管生成亦发生于动脉粥样硬化、类风湿关节炎、糖尿病视网膜病变以及癌症.特别是实体肿瘤的生长、转移与血管生成密切相关.因此,研究抗血管生成治疗或药物可能是抗肿瘤治疗的有效途径. 血管生成受到正负调节因子的调控,血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)是血管生成过程中主要的调节因子.应用免疫组化法检测乳腺癌等多种实体瘤中VEGF的表达水平, 发现均有VEGF及其受体的高表达,且与肿瘤血管计数有关,可作为判断癌转移和预后的临床监测指标.而许多的研究也已证实肿瘤血管密度(Microvessel density,MVD)是反映肿瘤血管生成的一个重要指标和有效的预后因子.
抗肿瘤血管生成治疗作为肿瘤治疗新的靶点,展示了良好的前景.建立各种体内血管生成模型及体外检测指标是实现寻找新的抗血管生成药物的关键.鸡胚绒毛尿囊膜实验(chick embryo chorioallantoic membrane,CAM)被认为CAM是研究血管生成较好的实验模型,其方法简便易于操作,便于推广,可用于影响血管生成的因素或药物的筛选和评价.
去甲斑蟊素(norcantharidin,NCTD)是我国设计合成的斑蟊素衍生物.实验证实对多种实验动物移植肿瘤具抑制作用,其抗肿瘤作用机制可能与诱导细胞凋亡及MAPK信号转导途径有关.因此,本文通过CAM实验的方法,研究去甲斑蟊素对鸡胚绒毛尿囊膜血管的抑制作用,以及对人乳腺癌MCF-7细胞CAM移植肿瘤的生长以及血管生成方面的影响,探讨其抗肿瘤作用机制以及作为一种特异性血管生成抑制剂的可能性.
方法：
1.鸡胚绒毛尿囊膜血管生成实验在孵育7天的鸡胚上开窗形成假气室,建立鸡胚绒毛尿囊膜模型.24小时后,将不同剂量的NCTD(72,36,18,9μg·20μL<-1>·胚<-1>·天<-1>)加在明胶海绵载体上,以生理盐水(20 μ L·胚<-1>·天<-1>)为溶剂对照,继续孵育,共3天.鸡胚发育第11天,固定取膜,解剖显微镜下观察并记录载体周围5mm范围内的可见血管分支点数.血管生成抑制率按照下面公式计算:血管生成抑制率(﹪)=(对照组血管分支点数一给药组血管分支点数)/对照组血管分支点数x100﹪.
2.去甲斑蝥素对人乳腺癌MCF-7细胞株鸡胚绒毛尿囊膜移植瘤血管生成的影响将成功培养的人乳腺癌MCF-7细胞以8x10<7>/m1浓度按每胚100μl接种于孵育7天的鸡胚上,继续孵育.其中部分鸡胚每天于体视显微镜下原位观察移植肿瘤的成活、形态以及周围血管生长情况,记录其生长特性,体积V(mm<3>)=0.4×a<2>×b(a为长径,b为宽径),以5个瘤体及其均数代表肿瘤当日龄的体积,绘制生长曲线.
其余鸡胚随机分为72 ug/胚组,36 ug/胚组,18 ug/胚组,以及生理盐水对照组,每组6枚,肿瘤细胞接种24小时后,分别给予不同剂量的NCTD(72,36,18μg·20 μl<-1>·胚<-1>·天<-1>)以及生理盐水(20μ L·胚<-1>·天<-1>),共3天.接种第4天(鸡胚发育第11天)时对移植瘤取材,观察计数肿瘤周围5mm范围内大、小血管数目,计算血管生成抑制率.
移植瘤标本经固定,石蜡包埋、切片,HE和IHC染色,分别进行VEGF、CD34检测,测定肿瘤组织内MVD.结果分析采用Image-Pro Plus 5.0图像分析软件.
采用SPSSll.5统计软件进行统计学分析.计量资料以均数±标准差表示,两组之间采用成组t检验,两组以上采用多因素方差分析;计数资料采用卡方检验.以双侧P<0.05为差异有统计学意义,双侧P<0.01为差异有显著统计学意义.
结果：
(1)在鸡胚绒毛尿囊膜模型中,去甲斑蟊素对以明胶海绵为载体的鸡胚绒毛尿囊膜血管生成具抑制作用,且呈剂量依赖性.NCTD72ug、36ug,18ug,9ug/胚处理组血管分支均数分别为17.6±1.3,29.3±1.0,39.0±1.8,52.8±2.0,明显低于生理盐水对照组血管分支均数78.9±1.9,血管生成抑制率分别为77.7﹪,62.9﹪,50.6﹪和33.0﹪.
(2)成功建立人乳腺癌MCFu7细胞鸡胚移植模型.生理盐水对照组鸡胚于肿瘤细胞接种后2～3天形成肉眼可见的瘤体(直径约2mm).成瘤率约90﹪.接种6～8天瘤体直径可达5～7mm,此后生长趋缓.9～10天部分移植瘤出现中央坏死.
(3) 移植肿瘤可诱发血管生成,接种肿瘤细胞的鸡胚移植瘤周围的血管密度、分支明显多于明胶海绵载体周围血管,结果有统计差异.去甲斑蟊素能明显抑制MCF-7鸡胚移植肿瘤的生长及血管生成.在给予不同剂量的NCTD后,计数移植瘤周围5mm范围内血管分支均数,NCTD72ug、36ug,18ug,/胚处理组血管分支均数分别为30.6±1.2,53.8±2.5,69.2±3.2,明显低于生理盐水对照组血管分支均数96.7±1.6,血管生成抑制率分别为68.3﹪,44.4﹪和28.4﹪.
(4)移植瘤标本VEGF、CD34免疫组化图像分析结果显示,72ug、36ug组较生理盐水对照组VEGF阳性光密度值表达数明显降低,各组间差异显著.MVD检测肿瘤组织中200倍视野内微血管计数,NCTD36ug组MVD计数为(15.3±1.4)条,NCTD72ug组为(19.3±2.8)条,叫生理盐水对照组(20.0±1.7)条明显减少.
结论：
在鸡胚绒毛尿囊膜模型中,去甲斑蟊素能明显抑制新生血管的生成,同时能抑制人乳腺癌MCF-7细胞鸡胚移植肿瘤的生长,对于肿瘤诱导的血管生成具抑制作用.去甲斑蟊素能的抗肿瘤作用与抑制肿瘤血管生成有关.