研究背景我国是一个肝病大国,慢性肝病的发生率相对较高。肝硬化是各种慢性肝病经肝纤维化发展而来。肝纤维化是各种慢性肝病发展为肝硬化的必经病理改变。因此,深入研究肝纤维化的发病机制,尽早地干预肝纤维化的发生和发展,在一定程度上能有效地控制肝硬化。肝纤维化是指在细胞因子、病毒、及氧自由基的刺激下,肝细胞发生凋亡、坏死,活化的成纤维细胞或肌成纤维细胞增多,肝脏中胶原等细胞外基质过度增生,超过其降解的速度,导致肝脏内纤维结缔组织大量沉积的病理改变。近年研究发现,上皮-间质转换(EMT)是肝纤维化发生的又一重要机制。EMT指极性分布的上皮细胞表型发生改变,E-钙粘蛋白(E-cadherin)表达减少、细胞间紧密连接及粘附连接消失,细胞骨架遭到破坏,获得间质细胞的表型;细胞内“波形蛋白(vimentin)”和“Ⅰ型胶原(CollA1)”表达增多,细胞迁移能力及收缩能力增强。按其生物学作用的不同,EMT可为三种不同的亚型:Ⅰ型EMT主要参与胚胎和器官发育过程;Ⅱ型EMT与伤口愈合及器官纤维化紧密相关;Ⅲ型EMT参与各种肿瘤形成与转移。NADPH氧化酶(NOX)来源的活性氧(ROS)是诱导EMT发生的重要机制。NOX由不同的亚基构成,不同亚基发挥调节作用的方式也不同。Nox1及Nox2主要受到后转录调节机制的控制,例如“基团的磷酸化”。相反,NOX4的活性却不受到这些因素的影响,其活性的变化主要是由其蛋白表达水平的变化所调节的。过氧化氢(H2O2)是ROS的主要组分。ROS可通过激活RhoA及smad通路诱导细胞发生EMT。然而,关于ROS是否能够诱导肝细胞EMT还鲜见报道。炎症小体是导致肝纤维化的新机制。炎症小体是一个细胞质多蛋白复合体,包括NLRP3、凋亡相关斑点样蛋白(ASC)、pro-caspase-1。NLRP3炎症小体的激活可促进caspase-1的裂解与激活,进而促使炎症因子例如IL-1β的成熟及释放。NLRP3炎症小体与细胞EMT密切相关,并在肾脏得到证实,并且NLRP3炎症小体在肝细胞中广泛存在。NOX来源的ROS可以激活NLRP3炎症小体。因此,NLRP3炎症小体是否可被肝细胞内ROS激活进而诱导肝细胞EMT呢?肾素-血管紧张素系统(RAS)在肝纤维化的发生及发展过程中发挥着重要作用。血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)是RAS的主要效应分子,具有较强的促氧化作用。新近研究认为AngⅡ可通过激活ROS从而诱导肾小管上皮细胞发生EMT。然而,在肝脏中,关于AngⅡ是否可诱导肝细胞EMT还鲜见报道。有趣的是,ACE抑制剂-captopril,可以抑制caspase-1的活性,该研究结果说明了 AngⅡ对炎症小体具有潜在的激活作用。因此,AngⅡ是否可通过激活NOX来源的ROS从而激活NLRP3炎症小体诱导肝细胞EMT呢?随着对RAS研究的不断深入,RAS的另一重要分支:血管紧张素转化酶Ⅱ-血管紧张素(1-7)-Mas受体轴(ACE2-Ang(1-7)-Mas Axis)受体轴被发现,并且该轴对ACE-AngⅡ-AT1R轴有显著的抑制作用。Ang(1-7)能与Mas受体结合,拮抗AngⅡ的活性,是AngⅡ的内源性阻断剂,并具有较强的抗氧化作用。那么,Ang(1-7)是否可以抑制AngⅡ诱导的肝细胞EMT呢?研究目的本研究通过以下体内外实验,观察Ang(1-7)是否可以通过抑制NOX来源的ROS介导的NLRP3炎症小体/smad通路从而逆转AngⅡ诱导的肝细胞EMT,为肝纤维化的防治提供新的策略。研究方法1 细胞培养人正常肝细胞株(L02)培养在含20%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 mg/L链霉素的RPMI1640高糖培养基中,置于37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱内常规传代培养。实验用细胞均为对数生长期细胞。2 实验动物模型构建本研究构建两种动物模型。1.将雄性健康的wistar大鼠随机分为两个组:假手术组及AngⅡ刺激组,每组6只。大鼠皮下均植入微量泵,每个微量泵可持续泵入4周。假手术组持续泵入生理盐水,同时,AngⅡ处理组老鼠按25 mg/kg-1·h-1的速度进行泵注。2.将雄性健康的wistar大鼠随机分为3个组:假手术组,胆管结扎组、胆管结扎+Ang(1-7)治疗组。假手术组老鼠持续泵入生理盐水,并打开腹腔,但不进行胆管结扎;BDL组大鼠持续泵入生理盐水,同时行胆管结扎手术。Ang(1-7)治疗组老鼠采用上述微量泵,以25 mg/kg-1·h-1的速度泵入Ang(1-7)同时行胆管结扎手术。统一于第四周宰杀大鼠,收集新鲜肝脏组织进行检测。3免疫组织化学将切片常规脱蜡至水,采用枸橼酸溶液微波进行修复,中高火10分钟,中低火7分钟,取出后自然冷却至室温。后采用过氧化物酶封闭液进行封闭,清洗后采用3%的BSA进行封闭1h,与相应的一抗Col1A1(1:100,Proteintech),NOX4(1:100,Abcam),进行孵育,4℃过夜。PBS清洗3次,每次5分钟,后与亲和素复合物孵育,再用DAB进行显色,滴上封片剂封片。在光学显微镜下进行观察比较。4羟脯氨酸检测:取肝组织,采用碱水解法测定肝组织中羟脯氨酸的含量,羟脯氨酸在氧化剂的作用下所产生的氧化物与二甲氨基苯甲醛作用呈紫色,根据其呈色的深浅可推算出其含量。5 过氧化氢含量测定:加入裂解试剂于预冷的研钵中,称取0.5 g的肝组织放在预冷的研钵里,加入少量液氮进行研磨,将研磨后的液体吸入EP管中,置于冰上,充分震荡裂解后,于15000 rpm,4℃离心15 min,吸取上清液。在96孔板中加入检测试剂,每孔加入200 ul上清液,制作对照孔,37℃孵育30 min,采用酶标仪检测OD值,根据标准曲线算出每组的H2O2的含量。6 细胞内ROS含量检测细胞内ROS采用DCF-DA探针检测法进行检测。首先采用不含血清的RPMI培养基将ROS检测液进行倍数均匀稀释,使其终浓度为10 μm/ul.将96孔板内的完全培养基轻轻洗出,用PBS进行清洗,排除血清的干扰,后加入稀释好的ROS检测液,每孔100μl,于37℃的温箱中避光孵育1 h.在避光的环境中将检测液洗出,用4℃的PBS清洗培养板,立即加入不含酚红的RPMI1640溶液入培养板,采用多功能酶标仪及荧光显微镜进行比较。7 细胞迁移实验准备24孔transwell板,将刺激后的细胞充分消化下来,离心弃去培养液,PBS洗1～2遍,同时每个Transwell小室的下室内加入500 μl含10%血清的培养基。离心后的细胞用1ml不含血清的RPMI培养基重悬,采用血细胞计数板分别计数。每组取10000个细胞,并将每孔细胞悬液调整到200 ul,加入上室中。用无血清的DMEM培养基悬浮细胞,调整细胞密度,调整细胞密度至1×105/ml。取细胞悬液200 μ1加入transwell上室,轻轻移至孵箱,并于37℃、5%CO2条件下孵育,待观察到部分细胞以发生迁移后取出Transwell小室,甲醇固定30 min后,用棉签轻轻擦去滤膜上室面的细胞,于室温下风干,后采用0.1%结晶紫对下室面的细胞染色20 min。PBS充分清洗后,光学显微镜下直接观察过膜的细胞数,并拍照,随即取5个视野,进行计数每个视野内的细胞数,重复3次,统计。8 细胞免疫荧光按1×105/孔接种细胞于放有盖玻片的24孔板中。细胞贴壁后,弃培养基,更换为无血清培养基,予以不同的刺激,置于培养箱于37℃、5%CO2条件下孵育,48 h后弃去培养液,PBS冲洗3次后,4%多聚甲醛固定30 min,PBS冲洗3次,采用0.5%Triton打孔15 min,PBS冲洗3次,于室温条件下3%BSA封闭30 min,PBS冲洗3次,5 min/次。将玻片取出,在细胞面分别加入3%BSA稀释的相应抗体30ul,4℃孵育过夜。PBS冲洗后,在细胞面加入PBS稀释的FITC标记山羊抗兔二抗、Cy3标记山羊抗鼠二抗、FITC标记驴抗山羊二抗30ul,置于避光湿盒内37℃孵育1h,PBS冲洗3次,5 min/次,DAPI荧光封片剂封片,于激光共聚焦显微镜观察。9琼脂糖迁移实验采用AngⅡ刺激肝细胞72 h,刺激完毕后将细胞从培养板上消化下来,终止消化后,将AngⅡ刺激的细胞进行PKH 67绿色荧光染色,对照组细胞采用PKH 26红色荧光染色,并用不含血清的RPMI1640将这两种染色细胞轻柔的混匀在一起加在琼脂糖板的的孔中,置于置于培养箱于37 ℃、5%CO2条件下孵育,在血清吸引下,中心孔内细胞向四周充满血清的孔中迁移,48 h后置于荧光显微镜下观察,通过比较不同颜色细胞迁移的距离来观察细胞迁移能力的改变。10 Western blot提取细胞总蛋白,采用BCA法测定蛋白浓度,加入上样缓冲液高温变性。将总蛋白提取液加入事先制备好的丙基酰胺凝胶电泳槽中进行蛋白电泳,目的蛋白分离后,进一步进行转膜、非特异性抗原封闭以及抗体孵育,完成后以远红外成像仪检测目的蛋白荧光值并进行半定量分析。11 RhoA pull-down 实验提取细胞总蛋白,采用BCA法测定蛋白浓度,取500μg的蛋白与结合有GST-Rhotekin-RBD的琼脂糖磁珠混合,并定容至1mL,用封口膜将管口封闭。于4℃水平晃动孵育过夜,次日以6000 g离心30 s,吸去上清后,将沉淀用预冷的wash buffer颠倒混悬,6000 g离心30 s,重复3次,充分清洗,后每组EP管内加入50 μ1 2×SDS重悬沉淀,并于沸水中煮5-10min,后自然冷却放入-80℃冰箱保存。后采用Western blotting方法进行检测。12 Rac1 pull-down 实验提取细胞总蛋白,采用BCA法测定蛋白浓度。取500 μg的蛋白与结合有GST-Rac1-RBD的琼脂糖磁珠混合,并定容至1 mL,用封口膜将管口封闭。于4℃水平晃动孵育过夜,次日以6000 g离心30 s,吸去上清后,将沉淀用预冷的wash buffer颠倒混悬,6000 g离心30 s,重复3次,充分清洗,后每组EP管内加入50 μl 2×SDS重悬沉淀,并于沸水中煮5-10 min,后自然冷却放入-80℃冰箱保存。后采用Western blotting方法进行检测13 NOX4与Rac1免疫共沉淀提取细胞总蛋白,采用BCA法测定蛋白浓度。取1000 μg的蛋白提取物分别进行与诱饵抗体孵育、琼脂糖连接蛋白A/G孵育、离心沉淀、蛋白高温变性等处理,获得目的蛋白后,行蛋白免疫印迹实验分析目的蛋白含量改变情况。14 Si RNA转染实验接种生长状态良好1×105～5×103个目的细胞接种于6孔培养板中,待细胞的融合率约为30%～50%时将培养基弃去,PBS清洗3次,加入opti-mem培养基。采用opti-mem培养基将Lipo2000及50 nM siRNA按50:1进行稀释,将Lipo2000与siRNA进行混合,于室温静置15 min。按步骤将NTsiRNA及目的siRNA转入细胞,6小时后换为完全培养基。经48h后进行后续刺激。15统计学方法应用SPSS 13.0统计学软件,结果数据以均数±标准差表示。采用oneway ANOVA方差分析法,首先利用Levene方法进行方差齐性检验,确定方差齐性且整体比较组间差异有统计学意义后进一步作多重比较,多重比较采用LSD法。以p<0.05为差异有统计学意义。研究结果一、AngⅡ可以诱导肝细胞EMT。细胞免疫荧光染色结果显示:AngⅡ刺激72 h后,肝细胞内CollAl的表达显著升高,E-cadherin的表达显著下降;AngⅡ时间梯度及浓度梯度实验发现:AngⅡ可诱导肝细胞EMT,并呈时间及浓度依赖方式(p<0.05);琼脂糖迁移实验提示:AngⅡ刺激后肝细胞迁移能力显著升高。因此,我们认为AngⅡ可诱导肝细胞发生EMT。二、AngⅡ可诱导肝细胞内NOX来源的ROS大量产生AngⅡ刺激24h后肝细胞内ROS含量显著升高,并且ROS的主要组分H2O2的含量也显著上升(p<0.05),加入了 DPI及catalase进行阻断后,H2O2的产生被显著抑制(p<0.05),该实验结果表明AngⅡ诱导的ROS产生与NADPH氧化酶密切相关;AngⅡ刺激48h后,肝细胞内NOX4蛋白表达量显著升高(p<0.05)。同时,活性Racl pull-down实验发现:AngⅡ刺激后,肝细胞内活性Racl的表达显著升高(p<0.05)。Racl、NOX4免疫共沉淀实验结果表明:较对照组相比,AngⅡ刺激后Rac1与NOX4相互作用显著加强(p<0.05)。三、NOX来源的ROS调节AngⅡ诱导的肝细胞EMT。与AngⅡ刺激组相比,加入NOX的活性抑制剂DPI后,,e-cadherin表达显著上调,Col1A1的表达显著下降,AngⅡ诱导的EMT被显著抑制(p<0.05)。与AngⅡ刺激组相比,NOX4转染组e-cadherin表达显著上调,Col1 A1的表达显著下降(p<0.05)。Racl对AngⅡ诱导的肝细胞EMT具有显著的抑制作用。与AngⅡ刺激组相比,e-cadherin表达显著上调,Col1A1的表达显著下降(p<0.05)。加入H2O2清除剂catalase后AngⅡ诱导的肝细胞EMT得到显著抑制,e-cadherin表达显著上调,CollA1的表达显著下降(p<0.05)。AngⅡ刺激后RhoA的活性显著升高,moesin磷酸化明显增强,加入相应抗氧化剂后RhoA的活性下降,moesin的磷酸化受到明显抑制(p<0.05)。Transwell迁移实验也得出相似的结论(p<0.05)。因此,NOX来源的ROS可调节AngⅡ诱导的肝细胞EMT。四、AngⅡ通过激活NOX来源的ROS所介导的NLRP3炎症小体/smad信号通路诱导肝细胞EMT。细胞免疫荧光染色结果表明:AngⅡ刺激后肝细胞内NLRP3、ASC、caspase-1蛋白表达增强。Western blot方法观察到AngⅡ刺激后肝细胞内NLRP3炎症小体组分的蛋白表达水平显著升高(p<0.05);采用NLRP3siRNA干扰,实验表明:NLRP3干扰后,AngⅡ诱导的肝细胞EMT受到显著抑制,E-cadherin表达显著上升、viemntin、Col1A1受到显著抑制(p<0.05);同时给予caspase-1抑制剂进行阻断后肝细胞EMT受到明显抑制,E-cadherin表达显著上升、vimentin、Col1A1表达显著下降(p<0.05);IL-1β刺激后,肝细胞内E-cadherin表达显著回升,vimentin、CollA1表达下降,且smad信号通路显著激活(p<0.05)。Transwell实验结果表明:IL-1β刺激后,肝细胞迁移能力显著增加(p<0.05),但是IL-1β没有放大AngⅡ的作用。予以NADPH氧化酶抑制剂DPI后,NLRP3炎症小体的蛋白表达水平显著下降。smad4siRNA转染验证了smad信号通路对AngⅡ诱导的肝细胞ETM的调节作用,在予以NLRP3siRNA进行干扰后,smad的磷酸化显著减低(p<0.05),同时给予IL-1 β体外进行刺激后,smad2/3的磷酸化显著增强(p<0.05)。五、Ang(1-7)可通过抑制NOX来源的ROS所介导的NLRP3炎症小体/smad通路逆转AngⅡ诱导的肝细胞EMT。首先,我们发现给予Ang(1-7)进行阻断后,较AngⅡ刺激组相比,E-cadherin表达显著上升、vimentin、Col1Al表达下降(p<0.05)。其次,Ang(1-7)可显著抑制AngⅡ诱导的H2O2生成、NOX4的蛋白表达增加(p<0.05)及Rac1分子活性的升高(p<0.05)。因此,Ang(1-7)具有较强的抗氧化的作用。同时,Ang(1-7)可以抑制NLRP3炎症小体/smad通路从而抑制AngⅡ诱导的EMT,表现为Ang(1-7)可显著抑制AngⅡ诱导的NLRP3炎症小体各组分蛋白表达水平的升高,同时smad2/3的磷酸化受到显著抑制(p<0.05)。Transwell迁移实验结果表明予以Ang(1-7)预处理后,AngⅡ诱导的细胞迁移受到显著抑制(p<0.05),且调节细胞迁移的RhoA/ROCK信号通路的关键分子RhoA的活性也被显著抑制(p<0.05)。因此,Ang(1-7)可通过抑制NOX来源的ROS所介导的NLRP3炎症小体/smad通路抑制AngⅡ诱导的肝细胞EMT。六、AngⅡ持续灌注可激活大鼠肝组织内ROS相关的NLRP3炎症小体,并诱导肝细胞内Col1Al及FSP-1表达增加。首先,采用免疫荧光双染的方法观察大鼠肝组织中肝细胞的表型变化。我们采用Albumin与Col1A1、Albumin与FSP-1共染。实验结果表明:AngⅡ刺激后大鼠肝细胞内Col1A1、FSP-1等间质蛋白表达显著增加,这表明肝细胞表型发生改变,向间质细胞过渡。Western blot结果表明:肝组织的上皮标志蛋白的表达水平下降,而间质蛋白的表达水平显著增加(p0.05)。在观察到这一现象后,我们对肝组织内氧化应激水平进行检测。Albumin与NOX4免疫荧光共染结果表明:AngⅡ刺激后大鼠肝细胞内NC)X4的表达显著增加(p<0.05),同时肝组织中H2O2含量增加(p<0.05),该实验结果表明:AngⅡ持续泵入可导致肝组织内氧化应激的水平显著升高。在AngⅡ的持续作用下,肝细胞内NLRP3炎症小体各组分蛋白及smad2/3的蛋白表达水平均显著升高(p<0.05)。该结果提示NLRP3炎症小体在AngⅡ刺激的大鼠肝组织中被激活。七、Ang(1-7)抑制胆管结扎大鼠肝脏中ROS相关的NLRP3炎症小体的激活,并降低大鼠肝细胞内Col1A1的表达。首先,我们采用masson染色法,观察各组大鼠肝组织中胶原纤维及其他细小纤维的增生程度。实验结果表明:较假手术组相比,胆管结扎大鼠肝组织胶原纤维大量增生,正常肝脏组织结构受到明显破坏。加入Ang(1-7)进行治疗后,肝组织内胶原纤维及细小纤维的含量显著减少。免疫组织化学染色法对肝组织内Col1A1的表达进行观察,该结果与masson染色的结果一致。胆管结扎大鼠肝组织中NOX4的表达显著升高,加入Ang(1-7)进行治疗后,肝组织内NOX4的表达显著下降,Western blot检测得出了相同的实验结果(p<0.05)。胆管结扎大鼠中H2O2的含量显著升高,给予Ang(1-7)进行治疗后,H2O2的含量显著下降(p<0.05)。因此Ang(1-7)可显著降低胆管结扎大鼠肝组织的氧化水平。Western blot检测结果表明:胆管结扎大鼠肝组织内NLRP3炎症小体各组分的蛋白表达显著升高,加入Ang(1-7)进行治疗后,肝组织中炎症小体的表达显著下降,并且smad2/3的磷酸化也受到显著抑制(p<0.05)。同时,我们采用Western blot方法检测肝组织中EMT相关分子蛋白表达水平。结果表明,胆管结扎大鼠中e-cadherin表达显著下降,而vimentin及Col1A1的表达显著升高,Ang(1-7)治疗组e-cadherin表达显著回升,而vimentin及Col1A1的表达显著下降(p<0.05)。我们采用免疫荧光双染技术,用Albumin定位肝细胞,进一步观察肝细胞内蛋白的表达变化。结果发现:胆管结扎大鼠中albumin与Col1A1双染阳性的细胞数较假手术组明显增多,而加入了 Ang(1-7)治疗后双染阳性细胞显著较少。该实验结果表明:在胆管结扎组中肝细胞内Col1A1表达增加,而加入了 Ang(1-7)进行治疗后肝细胞内Col1A1合成显著下降;同样,Ang(1-7)治疗后肝细胞内NLRP3及NOX4的表达均较AngⅡ治疗组显著下降。这表明:Ang(1-7)抑制胆管结扎大鼠肝脏中ROS相关的NLRP3炎症小体的激活,并抑制肝细胞向间质细胞转化。研究结论一、AngⅡ可通过激活NOX来源的ROS所介导的NLRP3炎症小体/smad信号通路诱导肝细胞EMT。二、Ang(1-7)可通过阻断NOX来源的ROS所介导的NLRP3炎症小体/smad信号通路从而逆转AngⅡ诱导的肝细胞EMT,维持肝细胞的正常表型及功能。三、AngⅡ可导致大鼠肝组织ROS相关NLRP3炎症小体激活,并诱导肝细胞内Col1A1及FSP-1表达升高。四、Ang(1-7)可抑制胆管结扎大鼠肝细胞中ROS相关NLRP3炎症小体的激活及Col1A1的生成。