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随着全球的临床医生们意识到维生素D缺乏的危害性,检测不同人群的维生素D水平的样本量已越来越多。25羟维生素D (25(OH)D)主要包括肝脏代谢的25羟维生素D3和25羟维生素D2两种产物,是评估机体维生素D状态的直接指标。目前主要使用免疫学的方法检测血清25(OH)D,但这类方法由于抗体的交叉反应以及不能等效的识别维生素D3和D2,导致检测的特异性、准确性和灵敏度都受到限制。采用液相串联质谱法(LC-MS/MS)能够有效的避免免疫学方法面临的各种技术问题,能够灵敏且特异的测定血清中的25(OH)D浓度。本文首先使用液相串联质谱分析仪建立了样本固相萃取—液相分离—质谱分析的检测血清25(OH)D的新方法,此方法能够特异性的检测出血清样本中的25(OH)D2和25(OH)D3浓度。参照美国FDA的生物分析方法验证导则标准对所建方法进行基本性能验证：①25(OH)D2和25(OH)D3的检测线性范围为6.25～500 nmol/L。②25(OH)D2和25(OH)D3的定量检出限分别为2.5和1.25 nmol/L。③批内、批间的CV分别<4%和<6%。④回收率结果为93.26-112.16%。⑤EQAS室间质评结果偏倚<10%。结果表明所建立的LC-MS/MS基本性能符合评价标准,能够灵敏且准确的检测出血清中25(OH)D2和25(OH)D3的浓度。使用目前常用的3种检测25(OH)D的电化学发光法(ECLIA)、微粒子酶免法(MEIA)和酶联免疫吸附发(ELISA)的免疫学方法与LC-MS/MS同时检测190份健康体检的血清样本,比较各种方法与LC-MS/MS的检测结果一致性。结果显示：①ECLIA、MEIA、ELISA与LC-MS/MS的相关系数分别为0.79、0.69、0.56。②ECLIA、MEIA、ELISA的25(OH)D2识别反应率分别为42.42%、24.05%、9.22%。③随着25(OH)D2含量%的增加,3种方法均产生明显的负偏倚。结果表明免疫学方法检测25(OH)D的结果准确性尚存在问题,尤其是在个体补充维生素D2的情况下会明显低估25(OH)D的检测结果。检测271例临床确诊为丙型肝炎患者和218例表面健康人的血清25(OH)D浓度,测定丙肝组的病毒载量(HCVRNA),并计算肝脏纤维化指数(Fibrotest).比较丙肝组与健康对照组间25(OH)D浓度水平的差异,分析丙肝组病毒载量、肝脏纤维化指数(Fibrotest)与25(OH)D浓度的关系。结果显示：①丙肝组和健康对照组的25(OH)D浓度均值分别为49.31±1.39nmol/L VS 60.42±1.34 nmol/L,有显著统计学差异(P<0.01)。②丙肝组的25(OH)D缺乏(<50nmol/L)和严重缺乏(<25nmol/L)的比例为41.33%(112/271)和14.4%(39/271),明显高于健康对照组的27.98%(61/218)和3.67%(8/218),有显著统计学差异(P<0.01)。③病毒载量和Fibrotest值的高低与25(OH)D浓度无明显相关性(P>0.05)。结果表明丙肝患者的25(OH)D水平明显低于健康人,应对其进行维生素D补充治疗。本文建立的LC-MS/MS检测血清25(OH)D的方法是一种灵敏且特异的方法,与传统的免疫法相比能够简单、快速并且准确的定量检测25(OH)D2和25(OH)D3,能为临床评估个体的维生素D状态及相关研究提供准确的检测结果。