论文部分内容阅读
目的:低氧是肿瘤微环境的重要特征之一。在低氧环境中,低氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor 1α,HIF-1α)促进肿瘤发展与演进。HIF-1α的合成与稳定性受氧浓度调控。在肿瘤内部呈现低氧的条件下,HIF-1α的两个脯氨酸残基被氧依赖的脯氨酸羟化酶羟基化的活性受到抑制,α亚基能稳定存在细胞胞浆中,泛素化降解途径受阻,并与核转录因子蛋白家族NF-κB协同作用,将α亚基转运至细胞核内,与结构性亚基HIF-1β形成稳定并且具有调控转录功能的二聚体,结合到特异的核苷酸序列,即缺氧反应元件(hypoxia responsive element,HRE)从而形成复合体,激活下游相关40多种基因的表达,调控血管、淋巴管的生成,能量的摄入,细胞的存活、增殖和侵袭转移等生物学行为,因此,靶向抗HIF-1α的蛋白合成,核转位及稳定性的药物研究,具有潜力,对肿瘤转移,易复发的治疗具有重大意义。肿瘤是严重威胁人类健康的杀手之一,其中,肝癌因预后易复发,易转移等特征成为致死率第三的癌症。褐藻多糖硫酸酯(Fucoidan),主要存在于褐藻体内,是一种富含硫酸酯的水溶性硫酸化杂聚糖。由于海洋生物资源丰富,富含具有药用价值活性物质,开发海洋药物已经成为当今研究的热点,其中多糖类物质具有多种生物活性,并且毒副作用小,因此,对fucoidan的生物活性研究更具潜力。本实验以具有淋巴道高转移能力的小鼠肝癌Hca-F细胞为模型,研究低氧环境下抑制淋巴道转移的功能及机制研究是理想细胞株。但是,近年来fucoidan对低氧环境下,对肝癌细胞的淋巴道转移与肿瘤细胞内部淋巴管新生能力的影响少见文献报道。方法:1.本文以氯化钴(Carbonyl chloride,CoCl2)模拟实体肿瘤低氧微环境。本实验设常氧,低氧,低氧加fucoidan组(100-400 g/ml fucoidan),采用MTT法检测构建低氧环境的Co Cl2作用Hca-F细胞的最适时间及作用药物浓度。2.探究低氧条件下,fucoidan对小鼠肝癌Hca-F细胞生长、HIF-1α表达、淋巴管新生及侵袭转移能力的影响以及fucoidan的干预作用。首先,采用CCK-8法,研究fucoidan在低氧环境下对Hca-F细胞活力的抑制作用。其次,采用western bloting、q RT-PCR及IFA法,研究fucoidan对Hca-F细胞中HIF-1α的表达及转位的抑制作用,及其调控的下游基因,包括促进淋巴管新生的生长因子VEGF-C和肝细胞生长因子HGF及其受体VEGFR-3和C-Met的表达的影响。最后,采用Transwell实验,探究fucoidan对低氧诱导Hca-F细胞迁移和侵袭能力的影响,以及促进肿瘤淋巴道转移ECM降解相关的基质金属蛋白酶MMP-2、MMP-9和抑制剂TIMP-1的表达。3.探究低氧条件下,fucoidan抑制小鼠肝癌Hca-F细胞HIF-1α表达相关信号通路关键作用因子的表达的影响。采用western bloting、qRT-PCR及IFA实验,研究具有高淋巴道转移潜力的Hca-F细胞中HIF-1α合成的PI3K/AKT/mTOR信号通路的表达及fucoidan的干预作用。结果:1.实验结果表明:Co Cl2(100 mol/L)作用于Hca-F细胞24h,显著上调HIF-1α蛋白和mRNA的表达(P<0.01),因此成功建立体外低氧微环境。2.Fucoidan在低氧环境下作用于Hca-F细胞24h,可以下调NF-κB、MMP-2、MMP-9的表达,上调TIMP-1的表达,同时,细胞迁移和侵袭能力亦下降。并且fucoidan作用于Hca-F细胞,下调VEGF-C和HGF的表达。同时,小鼠体内实验,通过免疫组化结果显示:肿瘤内部淋巴内皮细胞成管结构不完全,能力下降,小鼠体内肿瘤淋巴管数显著减少,存在结构缺陷等现象。小鼠内皮淋巴细胞mLEC体外成管实验,在低氧条件下,mLEC细胞成管能力增强,成管数量明显增多,在fucoidan的干预作用下,mLEC细胞成管能力降低,数量相对低氧对照组,明显减少。3.高淋巴道转移潜力的Hca-F细胞中HIF-1α合成的PI3K/AKT/mTOR信号通路中,功能活性的p-PI3K/p-AKT/p-mTOR在低氧环境下的相对表达量比常氧环境下明显升高,效果显著,在fucoidan的干预作用下,p-PI3K/p-AKT/p-mTOR信号通路钝化。结论:在低氧环境下,fucoidan显著抑制小鼠肝癌Hca-F细胞侵袭,淋巴管新生和淋巴道转移的潜能,可能与NF-κB和HIF-1α的表达下调,钝化PI3K/AKT/mTOR和ERK信号通路有关。