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毒品成瘾是一种慢性、复发性脑疾病,其特征是对毒品强烈的渴求和不计后果的反复使用。高达90%的复吸率是戒毒工作面临的主要挑战。经长时间戒断后再次接触与毒品有关的线索和环境所诱发的毒品渴求是导致复吸的重要原因。有学者报道,在毒品戒断初期,由线索诱导的对毒品的渴求会随戒断时间逐渐增加,且较长时间保持在高水平,称之为“药物（毒品）潜伏心理渴求（incubation of drug craving）”。该现象在多种毒品如尼古丁、酒精、甲基苯丙胺和可卡因戒断后都被观察到。但对毒品潜伏心理渴求产生的机制依然不明确。伏隔核（NAc）是公认参与毒品成瘾形成、奖赏强化、心理渴求和复吸等各个阶段的重要核团。伏隔核内的多巴胺能神经投射环路与毒品奖赏和强化效应密切相关,而谷氨酸能神经投射环路则参与了毒品心理渴求形成。研究发现,伏隔核内脑源性神经生长因子（BDNF）、神经营养蛋白-4（NT-4）、组蛋白脱乙酰基酶-3（HDAC3）及即早基因Arc、Egr1等多种分子在毒品潜伏心理渴求中均发挥了重要作用,且伏隔核神经元内的一些分子变化可作为评估毒品心理渴求程度及复吸率的生物标记物。近年来,circRNA受到学者的关注,它以一种非经典的剪接形式产生,并且在生物体的基因表达程序中普遍存在。circRNA可作为一种竞争性内源RNA（ce RNA）,通过竞争性结合miRNA,从而调控基因表达水平与细胞功能。近来研究发现circRNA在帕金森病、阿尔茨海默病、缺血性脑损伤等中枢神经系统疾病的发生发展过程中均发挥了重要作用。然而,circRNA在毒品成瘾过程中尤其是对毒品潜伏心理渴求的作用尚未见报道。基于以上研究背景,本研究拟在建立小鼠吗啡条件位置偏爱（CPP）潜伏心理渴求模型基础上,采用高通量测序、生物信息学分析、转录组学等技术,深入探讨circRNA—miRNA—m RNA调控轴在吗啡潜伏心理渴求过程中的作用,以丰富对毒品成瘾机制的认识,为复吸防治提供新的干预靶点。第一部分 吗啡诱导潜伏心理渴求模型建立及目标circRNA的筛选目的:应用CPP建立小鼠吗啡潜伏心理渴求模型,然后采用高通量测序技术检测模型小鼠伏隔核内circRNA表达谱变化,通过qRT-PCR、FISH、生物信息学分析筛选目标circRNA。方法:首先,以小鼠皮下注射（s.c.）1mg/kg、5mg/kg或10mg/kg吗啡进行程序性交替训练6天,分别在吗啡戒断后第1天（T1/WD1）、第14天（T2/WD14）进行CPP测试,以建立潜伏心理渴求模型。模型建立成功后,通过高通量测序技术检测吗啡潜伏心理渴求小鼠伏隔核内circRNA表达变化。然后,通过生物信息学分析及qRT-PCR验证测序结果中表达增高的circRNA,并选取目标circRNA（circTmeff-1）。进一步通过FISH技术验证目标circRNA在伏隔核的表达变化并明确其细胞定位。伏隔核总RNA经RNase R消化后,qRT-PCR验证目标circTmeff-1为环状RNA。结果:1.皮下注射5mg/kg或10mg/kg吗啡,进行程序性交替训练6天,于戒断后14天（WD14）CPP评分明显高于戒断后1天（WD1）,而低剂量吗啡（1mg/kg）无此作用。2.circRNA测序数据显示,WD14组与WD1组比较有16条circRNA发生了显著变化,其中7条circRNA上调,9条circRNA下调。3.qRT-PCR结果显示,WD14组中circTmeff-1,circ Dmxl2,circ Pik3c表达量明显高于WD1组,与测序结果一致。4.FISH结果表明,WD14组与WD1组比较circTmeff-1表达量明显增高,且circTmeff-1主要表达于细胞胞质中。5.经RNase R消化后,应用反向引物及对向引物分别扩增circTmeff-1和Tmeff-1 m RNA。qRT-PCR结果显示,circTmeff-1耐受RNase R消化,而m RNA被RNase R消化。6.在小鼠不同脑区及不同细胞系中观测circTmeff-1的表达,qRT-PCR结果显示,circTmeff-1在小鼠伏隔核及小鼠海马神经元细胞系中高表达。小结:5mg/kg和10mg/kg吗啡CPP条件化训练,戒断后环境线索可诱导出稳定的潜伏心理渴求,吗啡潜伏心理渴求小鼠伏隔核内circRNA表达谱发生改变,其中circTmeff-1通过反向引物、RNase R消化等方法证实为一条环状RNA,其变化趋势与CPP评分一致,确定将circTmeff-1作为目标物进行后续实验。第二部分 CircTmeff-1在线索诱导吗啡潜伏心理渴求中的功能研究目的:通过调低或过表达小鼠伏隔核核部或壳部circTmeff-1,观察其对线索诱导吗啡潜伏心理渴求、小鼠自发活动、空间记忆和焦虑程度的影响,以明确circTmeff-1在线索诱导潜伏心理渴求中如何发挥作用。方法:首先,通过qRT-PCR明确线索诱导的潜伏心理渴求中circTmeff-1在伏隔核中表达部位。于WD14测试阶段,更换条件化训练时期CPP箱体的墙壁和/或地板,观测环境线索条件改变后的CPP评分,同时采用qRT-PCR检测更换墙壁和/或地板后伏隔核核部circTmeff-1的表达。然后,构建腺病毒载体（AAV）,通过qRT-PCR和Western blot验证AAV调低或过表达circTmeff-1效果。并应用CPP模型评价调低或过表达circTmeff-1对线索诱导吗啡潜伏心里渴求的影响。进一步以巴恩斯迷宫、旷场实验、明暗箱实验观测调低或过表达小鼠伏隔核核部或壳部circ T-meff-1对小鼠空间记忆、自发活动、焦虑程度的影响。结果:1.5mg/kg吗啡进行程序性条件化训练6天,戒断后1天（WD1）、戒断后7天（WD7）,戒断后14天（WD14）和戒断后28天（WD28）CPP评分逐渐增加,WD14组,WD28组与WD1组比较具有显著性差异,这与circTmeff-1在伏隔核表达趋势一致。2.qRT-PCR结果显示,WD14 CPP测试后伏隔核核部circTmeff-1表达量较WD1组明显升高,而壳部无变化;同时伏隔核核部circTmeff-1的表达在CPP测试组比未测试组显著升高。3.CPP评分结果显示,更换毒品条件化相关线索（墙壁和/或地板）可以降低小鼠对吗啡的渴求,其中更换墙壁和地板或仅更换地板与对照组比较均具有统计学差异,且circTmeff-1的表达与CPP评分相一致。4.AAV转染后1周,病毒标签荧光蛋白可以稳定表达,并可持续4周以上。qRT-PCR结果显示,构建的AAV可以明显降低或增加注射部位的circTmeff-1的表达。5.CPP评分显示,调低伏隔核核部circTmeff-1可抑制5mg/kg吗啡条件化训练诱导的潜伏心理渴求,过表达伏隔核核部circTmeff-1可提高1mg/kg吗啡条件化训练诱导的潜伏心理渴求,而伏隔核壳部无上述作用。6.巴恩斯迷宫结果显示,过表达或调低小鼠伏隔核核部或壳部circTmeff-1,小鼠到达目标箱的潜伏时间与对照组比较无差异。7.旷场实验结果显示,过表达或者调低小鼠伏隔核核部或壳部circTmeff-1小鼠30分钟运动距离与对照组比较无差异。8.明暗箱实验数据显示,过表达或者调低小鼠伏隔核核部或壳部circTmeff-1小鼠在明箱的滞留时间与对照组比较无差异。小结:线索诱导的吗啡潜伏心理渴求使小鼠伏隔核核部的circTmeff-1表达增高,而壳部无变化;潜伏心理渴求的表达可被条件化匹配的环境线索所诱导,并与伏隔核核部circTmeff-1的表达趋势相一致;调低伏隔核核部circTmeff-1可抑制5mg/kg吗啡条件化训练诱导的潜伏心理渴求,过表达伏隔核核部circTmeff-1可增加1mg/kg吗啡条件化训练诱导的潜伏心理渴求,而壳部无上述作用;小鼠伏隔核核部或壳部调低或过表达circTmeff-1对小鼠的空间记忆、自发活动及焦虑程度均无影响。第三部分 CircTmeff-1调节吗啡潜伏心理渴求的机制研究目的:通过生物信息学、qRT-PCR、FISH、双荧光素酶报告、RNA pulldown预测及验证与circTmeff-1结合的miRNA;并通过生物信息学、qRT-PCR及蛋白免疫印迹预测验证与目标miRNA作用的m RNA。此外,观测circTmeff-1对潜伏心理渴求相关蛋白AMPA1、AMPA2和BDNF的作用。构建并阐明伏隔核核部circTmeff-1--miRNA--m RNA调控网络。方法:首先,通过生物学信息学分析预测在miRanda,Target Scan和RNAhybrid数据库中与circTmeff-1结合的miRNA,并通过qRT-PCR在伏隔核核部进行验证。进而通过双荧光素酶报告基因、RNA pulldown、FISH等实验明确circTmeff-1与靶向miRNA的结合作用。并且,通过5mg/kg吗啡条件化训练诱导潜伏心理渴求模型,观测伏隔核核部微注射靶miRNA对潜伏心理渴求的作用。此外,通过生物信息学分析预测在miRanda和miRDB数据库中与miR-541-5p和miR-6934-3p共同结合的m RNA,并通过qRT-PCR在伏隔核核部进行验证。最后,通过Western blot观测靶蛋白在线索诱导吗啡潜伏心理渴求中的表达改变及circTmeff-1、miR-541-5p/miR-6934-3p对其表达的影响。结果:1.生物信息学分析预测结果显示miRanda,Target Scan和RNAhybrid数据库中与circTmeff-1结合共有33条miRNA,伏隔核核部qRT-PCR验证评分高的10条miRNA,其中4条miRNA表达趋势与预测结果相一致。2.双荧光素酶报告结果显示,miR-541-5p和miR-6934-3p可以与circTmeff-1结合,显著抑制反应体系荧光表达,miR-541-5p/miR-6934-3p抑制剂及突变circTmeff-1其结合位点可以翻转miR-541-5p和miR-6934-3p抑制荧光表达的作用。3.RNA pulldown实验结果显示,circTmeff-1可以与miR-541-5p和miR-6934-3p结合,pulldown组miR-541-5p和miR-6934-3p表达量明显高于对照组。4.FISH荧光图像显示,circTmeff-1主要表达于细胞浆,并且与miR-541-5p,miR-6934-3p共定位于胞浆。5.CPP评分显示,伏隔核核部微注射miR-541-5p可以明显降低WD14小鼠CPP评分,而miR-6934-3p降低作用无统计学意义。同时miR-541-5p及miR-6934-3p抑制剂均可以翻转调低circTmeff-1的抑制作用。6.生物信息学预测结果显示miRanda和miRDB数据库中与miR-541-5p和miR-6934-3p共同结合有5条m RNA;通过qRT-PCR验证,WD14伏隔核核部Vamp1及Nfasc的表达较WD1明显升高。7.Western blot结果显示,VAMP1和NFASC的表达WD14较WD1明显升高,过表达circTmeff-1也可以显著提高VAMP1的表达,miR-541-5p和miRNA-6934-3p均可翻转该作用;同时,miR-541-5p可以抑制NFASC的表达,而miR-6934-3p则无此作用。此外,在吗啡潜伏心理渴求模型中WD14与WD1相比,BDNF表达升高;AMPA2表达降低;AMPA1表达二者无差异。过表达circTmeff-1可以降低AMPA2的表达,升高BDNF的表达,这些作用可以被miR-541-5p和miR-6934-3p所翻转。小结:circTmeff-1可以与miR-541-5p和miR-6934-3p结合并抑制其作用;miR-541-5p和miR-6934-3p可以抑制VAMP1和NFASC的表达;通过circTmeff-1对潜伏心理渴求相关蛋白AMPA1、AMPA2和BDNF的作用验证circTmeff-1调控了潜伏心理渴求的过程。构建了circTmeff-1--miR-541-5p/miR-6934-3p--VAMP1/NFASC调控网络。结论:吗啡潜伏心理渴求小鼠伏隔核部circRNA表达谱发生改变,其中circTmeff-1表达显著升高;抑制伏隔核核部circTmeff-1的表达,可以明显抑制环境线索诱导的吗啡潜伏心理渴求;circTmeff-1参与调控吗啡潜伏心理渴求可能是通过circTmeff-1-miR-541-5p/miR-6934-3p-VAMP1/NFASC网络途径。此调控网络丰富了对毒品潜伏心理渴求的理论认识,为复吸的预防治疗提供新的干预靶点。