研究背景：年龄相关性黄斑变性(AMD)是发达国家50岁以上人群的主要致盲性眼病，而脉络膜新生血管(CNV)是导致严重视力丧失的主要原因。目前的治疗方法，如经瞳孔温热疗法(TTT)、光动力学疗法(PDT)，或者玻璃体内注射曲安耐德(TA)，虽然可以通过部分地下调多种血管发生因子的表达而发挥抑制CNV的作用，但存在显著的副作用，如全层视网膜损坏、中心视力丧失以及有限的应用指征和治疗后的高复发率。随着CNV的发病机理逐渐被阐明，目前的研究证实抗新生血管疗法可能更有利于CNV的治疗。基于拮抗血管生长因子(VEGF)或VEGF受体(VEGFR)这一原理，出现了新型的治疗方法如玻璃体腔注射bevacizumab(avastin)、ranibizumab(Lucentis)或pegaptanib(Macugen)。但此疗法仍然存在潜在的不足之处，有证据显示，单独抑制VEGF不足以有效抑制CNV。　　临床研究证实，Bruch膜的年龄相关性改变可导致外层视网膜缺氧，通过刺激视网膜色素上皮(RPE)细胞的VEGF过表达，进而促进CNV形成。缺氧诱导因子1(HIF-1)是缺氧活化的转录因子，在调节氧稳态、氧输送及肿瘤细胞的缺氧适应方面具有重要作用。作为哺乳动物对低氧压反应的主控开关，HIF-1在缺氧条件下调节多种基因的转录，包括VEGF、红细胞生成素(EPO)、和血小板衍生生长因子(PDGF)等。在CNV发生发展的过程中，这些基因共同发挥关键的作用。HIF-1由α亚基和β亚基组成。HIF-1β在常氧及缺氧状态下均稳定存在，而HIF-1α表达及活性受缺氧诱导，下调缺氧状态下HIF-1α的表达可抑制HIF-1的形成，从而降低其对VEGF的转录激活，因此，HIF-1α有可能成为基因治疗眼内新生血管疾病的靶点。阻断某种主控开关分子如HIF-1，不仅下调VEGF表达，同时协调多种其他非确定因子以获得协同效应，因而此治疗策略逐渐成为人们关注的研究热点。　　基因治疗是指把基因导入人体细胞，使其发挥生物学效应，从而达到治疗疾病目的的技术方法。眼部因位置浅表，易于基因导入治疗和观察，以及血-眼屏障的存在，是基因治疗的理想靶器官。已有研究证实，针对HIF-1α的小干扰RNA(siRNA)可抑制人RPE细胞的VEGF表达。在动物模型上应用针对VEGF或VEGFR的siRNA同样获得不同程度的抑制效果。通过玻璃体腔注射，靶向VEGF或VEGFR的RNA干扰(RNAi)的临床试验目前正在开展。可是，基因治疗存在的最大问题是在维持转入基因的高水平表达。siRNA等基因类物质在细胞内迅速被降解，因此只能短暂的抑制新生血管进程从而导致新生血管复发。为了获得眼内的长期基因表达或药效，必须在较长的一段时期内反复给予玻璃体腔注射，可能导致某些眼部并发症，如玻璃体出血、视网膜脱离或眼内炎。因此，为了达到治疗效果最大化和最小的副作用，合理的药物递送系统(DDS)成为眼部基因治疗的首要考虑。　　一个理想的释控体系必须在一定的时间内以持续的方式释放包载的药物。由聚乳酸聚乙醇酸共聚物(PLGA)和聚乙烯醇(PVA)制得的生物降解、生物相容性纳米粒已广泛应用在药物递送方面。它们在体内水解代谢，而对组织细胞没有毒性作用。通过改变分子量、亲水性和丙交酯与乙交酯之间的比率等理化特性，PLGA的降解速率可调控包载的基因物质或药物在细胞内以缓慢的速率释放。此外，包载在PLGA基质内的DNA片段受到纳米粒的保护而免于核酸内切酶的作用。因此，采用PLGA纳米粒包载可沉默HIF-1α的基因物质，可能为眼底新生血管疾病的基因治疗提供更安全、有效的途径。　　目的：(1)构建针对大鼠HIF-1α的短发卡式小干扰RNA(shRNA)表达载体；(2)进行PLGA纳米粒包载并评测纳米粒相关的各项指标；(3)观察纳米粒在视网膜内的穿透性、眼内分布，评价pshHIF-1α纳米粒对CNV的抑制效率；(4)检测纳米粒玻璃体腔注射对视网膜的毒性。　　方法：(1)针对大鼠HIF-1α特异性siRNA载体的构建、测序及内源筛靶：由上海吉凯基因公司提供pGCsi-U6/Neo/GFP/shRNA载体并代理构建了针对大鼠NM_024359基因(HIF-1α)4个靶点的RNAi载体并经过酶切鉴定测序。将包装了干扰序列的慢病毒颗粒感染大鼠小肠隐窝细胞IEC6，通过荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白(GFP)表达情况，RT-PCR检测目的基因mRNA表达情况。产生非靶向性的阴性对照序列的pGCsi-U6/Neo/GFP/shRNA载体作为本实验的无关序列对照。质粒均在DH5α大肠杆菌内扩增，利用无内毒素质粒大提试剂盒纯化，冻干。(2)载pshHIF-1α纳米粒的制备及其理化性质测定：采用乳化-溶剂挥发法制备载pshHIF-1αPLGA纳米粒乳液，常温挥发有机溶剂，高速离心机离心、洗涤后收集沉淀，冻干。紫外分光光度计检测纳米粒的包埋效率、载药率和体外释放速率。通过激光粒度分析及Zeta电位分析测定载pshHIF-1α纳米粒的粒度分布范围，利用透射电镜观察纳米粒表面形态和粒径范围。(3)动物模型建立及玻璃体腔给药：健康成年棕色挪威(BN)大鼠116只，每只大鼠随机选取1眼为实验眼，采用激光光凝建立CNV模型，另1只眼为对照眼。随机设立空白纳米粒组、PBS组、裸质粒组、无关序列对照组、载pshHIF-1α纳米粒转染组和单纯模型组。建模成功后给予玻璃体腔内注射，各组实验眼分别注入10μl空白纳米粒(1.89mg/ml)、pshHIF-1α(0.02mg/ml)、无关序列shRNA质粒纳米粒(1.89mg/ml)、pshHIF-1α纳米粒(1.89mg/ml)或PBS。(4)注射后3、7、14和28d过量麻醉处死大鼠，灌注后取眼球制成眼杯，行冰冻切片，DAPI染核后激光共聚焦显微镜下观察纳米粒在眼内的分布和视网膜穿透性。光凝后14d，通过荧光素眼底血管造影(FFA)观察CNV的荧光渗漏面积；过量麻醉处死动物，通过光学显微镜测定CNV平均中央厚度。(5)分别于0、7和28d对PBS组、空白纳米粒组、裸质粒组和pshHIF-1α纳米粒组进行闪光视网膜电图(f-ERG)检查检测视网膜功能。于激光后14d和28d，过量麻醉处死大鼠，取标本于透射电镜下观察视网膜组织超微结构改变。　　结果：(1)经测序证实克隆的4条干扰序列100％打靶正确。荧光检测结果显示，靶点病毒的感染效率均达到70％以上。Realtime-PCR检测结果显示相对于阴性对照病毒感染组，KD2号和KD3号靶点对IEC6细胞HIF-1α基因的表达敲减效率分别达到45％和40％。选取敲减效率较高的2号质粒进入下部分实验，其序列为：5′-CCAGTTGAATCTTCAGATA-3′。　　(2)78.7％载pshHIF-1α纳米粒集中分布在164nm～342nm之间，呈窄分布，平均粒度为284nm，Zeta电位为-8.91mV。透射电镜下纳米粒呈大小均匀的圆形或椭圆形粒子，直径在100nm～300nm左右。紫外分光光度法测得纳米粒包埋效率为60.2％，纳米粒中基因含量为1.06％。体外释放实验显示载pshHIF-1α纳米粒在体外最初5d为突释相，约有60％～70％的质粒DNA释放；在随后的23d呈稳态缓释。　　(3)玻璃体腔内注射后各时间点通过激光共聚焦对纳米粒的视网膜穿透性及转染效率观察显示，注射后3d载pshHIF-1α纳米粒组和无关序列对照组可见GFP在视网膜内层表达，此外，睫状体、脉络膜和CNV局部也可见绿色荧光表达。7d可见绿色荧光蛋白表达优先向RPE层聚集，并一直持续呈明亮的线状表达直至注射后4周后消失。裸质粒组在3d时可见散在荧光表达于视网膜及脉络膜，7d时已观察不到荧光表达，整个观察过程中无绿色荧光在RPE层呈线状聚集的现象。空白纳米粒组、单纯模型组和PBS组始终均未观察到荧光。　　(4)免疫荧光染色显示3d时HIF-1α表达于CNV局部，载pshHIF-1α纳米粒组和裸质粒组HIF-1α表达较其它组明显减少(P<0.01)。光凝后14d，FFA结果显示载pshHIF-1α纳米粒组较其它各组的CNV荧光素渗漏面积显著减少(P<0.01)，光学显微镜测定结果显示载pshHIF-1α纳米粒注射组的CNV平均中央厚度为58.28±9.57μm(n=10)，PBS组、空白纳米粒组、无关序列对照组、裸质粒组和单纯模型组的CNV平均中央厚度分别为是107.86±11.29μm(n=9)、99.85±10.42μm(n=9)、104.33±11.64μm(n=8)、91.79±8.78μm(n=10)以及102.2±8.3μm(n=10)，组间具有统计学意义(P<0.01)。　　(5)玻璃腔注射后各时间点f-ERG检测显示，PBS注射组、空白纳米粒组、裸质粒组和载pshHIF-1α纳米粒组等注射眼各组之间的ERG-a波与b波波幅值和峰时值相比均无明显差异(P>0.05)；而7d时各组的ERG-a波与b波波幅值和峰时值与其基线值(0d)相比均有降低和延长(P<0.01)，28d时则无明显差异(P>0.05)。玻璃体腔注射后14d透射电子显微镜下观察可见PBS组神经节细胞线粒体空泡化，膜盘结构完整，神经纤维层线粒体空泡化明显，微管及微丝结构紊乱。载pshHIF-1α质粒纳米粒组可见神经节细胞层线粒体空泡化明显，膜盘结构基本完整，视神经纤维层线粒体空泡化，微管扩张，微丝排列紊乱，神经节细胞胞浆内及近核膜处可见纳米粒，直径约为100nm，形状类圆形或不规则。28d时PBS组和载pshHIF-1α纳米粒组均仅可见神经节细胞轻度空泡化，微管、微丝结构轻度紊乱。　　结论：针对大鼠HIF-1α的siRNA表达载体可被成功构建，并进一步证实应用针对HIF-1αmRNA的RNAi技术可以抑制体内新生血管。PLGA纳米粒能延长其包载的shRNA被酶降解的时间，从而延长基因物质在体内的作用时间，较裸质粒组更有效地抑制大鼠激光模型的CNV生成。因此，作为新型、安全、有效的非病毒基因载体，PLGA纳米粒有可能为眼部新生血管性疾病的基因治疗提供新的治疗途径。