论文部分内容阅读
探索以基因治疗为主要手段的抗HBV感染治疗的研究是研究热点之一。目前应用于HBV感染基因治疗方案主要有DNA疫苗、核酶、反义核酸、干扰肽及干扰蛋白、Dominant negative突变体(DN突变体)、RNAi等，体外或体内模型上均显示出有效性。但由于病毒变异，上述方法需要不断重复给药，载体的安全性、特异性、高效性和可控性等问题，上述疗法临床应用还有相当一段距离。本研究拟构建一个具有生命体特征的HBV缺陷病毒，以其干扰和抑制HBV的体内复制状况，并通过调节机体对二种病毒的免疫反应，阻断HBV在体内的复制以达到抗HBV感染的目的。 所要构建的HBV缺陷病毒的特征是：其包膜和核衣壳与HBV完全相同，基因组结构中缺失HBV基因组的S基因和Pol基因，保留HBV基因组复制和包装所需的DR1、DR2、C基因和HBV 3’末端序列，并在缺失的部位引入人免疫调节基因表达盒和增强基因组复制的肝特异性增强子序列。 具体实施过程为：制备高表达HBV S基因和Pol基因的包装细胞，为乙肝缺陷病毒的制备作准备；构建含乙肝缺陷病毒基因组的重组逆转录病毒载体和含乙肝病毒基因组的重组逆转录病毒载体，共转染HepG2细胞，ELISA、PCR方法和斑点杂交初步研究乙肝缺陷病毒基因组对HBV复制的影响。 本研究分为三个部分：一、乙肝缺陷病毒包装细胞制备的初步研究；二、含乙肝缺陷病毒基因组的重组逆转录病毒载体和含乙肝病毒基因组的重组逆转录病毒载体的构建；三、乙肝缺陷病毒基因组对HBV复制影响的实验研究。 一 乙肝缺陷病毒包装细胞制备的初步研究 将HBV的Pol基因克隆到逆转录病毒载体pMSCV(neo)和pLNCX2中，将HBV的S基因克隆到逆转录病毒载体pLNCX2中，转染HepG2细胞，G418和Hyg筛选出的高表达Pol基因和S基因的细胞株为制备乙肝缺陷病毒的包装细胞作准备。Western Blot检测到单转染HBV S／pLHCX和共转染HBV S／pLHCX、HBV Pol／pMSCVneo抗性细胞中HBV S基因的表达。RT-PCR检测到HBV Pol基因的表达，SDS-PAGE电泳结果未显示阳性细胞与空载体转染及未转染的人肝癌细胞SMMC7721相比有阳性表达条带。P蛋白克隆表达的难度阻碍了筛选出的高表达Pol基因的细胞株为制备乙肝缺陷病毒的第二军医大学硕士学位论文中文摘要包装细胞作准备的工作。因此我们改变了策略，依然利用缺陷抑制这一思路探索乙肝病毒的基因治疗。构建含乙肝缺陷病毒基因组的逆转录病毒载体和含乙肝病毒基因组的重组逆转录病毒载体，来研究乙肝缺陷病毒基因组对HBV复制的影响。 二含乙肝缺陷病毒基因组的重组逆转录病毒载体和含乙肝病毒基因组的重组逆转录病毒载体的构建 Z‘肝缺陷病毒基因组(1550~2550+850~2050)包含HBVC基因片段(包含HBV基因组复制和包装所需的序列DRI、DRZ)和HBVX基因片段(HBV3’末端序列)而缺失了S基因(2848~3215~837)和Pol基因(2390~3215~1625)。 扩增能转录出HBVC基因片段(包含HBV基因组复制和包装所需的序列DRI、DRZ)和HBvx基因片段(HBv3’末端序列)，本别克隆到pMD18一T为中间载体二EeoRI/Salx消化HBvC/P MD一1 ST，Sall/Hpal消化HBV X/pMD一1 ST，回收HBV基因片段与EcoR 1/ Hpal酶切的pMscVne。载体连接，构建含乙肝缺陷病毒基因组的重组逆转录病毒载体HBV CX/PMSCVneo。 设计引物，扩增HBv基因组中1 550一2050~3210~2050的3700bP片段(长于HBv全长基因soobp(1550~2050一3210一1550))，以pMnls一T为中间载体，克隆到逆转录病毒载体pMscvneo，构建重组逆转录病毒载体HBv/P MSCVne。。在HBV全长基因500bp处的移码突变通过重叠PCR来纠正。 三乙肝缺陷病毒基因组对HBV复制影响的实验研究 将HBVC刀pMSCVneo和HBV/pMsevneo共转染HepoZ细胞，并设立空白对照，转染空载体和单转染HBv/P MSCvneo细胞对照，初步研究乙肝缺陷病毒基因组对HBv复制的影响。ELISA检测到转染细胞及上清中存在HBsAg，但单转染组与共转染组中的HBsAg量无显著性差异。抽提单转染组与共转染组细胞上清液中的病毒DNA，严格设置对照，半定量PCR结果显示乙肝缺陷病毒基因组对HBV复制的抑制率为0.461;斑点杂交结果显示乙肝缺陷病毒基因组对HBV复制的抑制率分别为0.3 12、0.404、0 .232。第二军医人学硕_I:学位论文中文摘要 本研究表明乙肝缺陷病毒基因组对HBV复制存在抑制作用。构建乙肝缺陷病毒的工作虽然存在难度，但通过制备乙肝缺陷病毒治疗HBV感染的构想是可行的。为下一步制备乙肝缺陷病毒及研究乙肝缺陷病毒对HBV复制的影响打下了基础。