猪生长激素基因的克隆及在COS-7细胞的表达研究

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本研究以长白猪垂体总RNA为模板,通过RT-PCR克隆了猪生长激素(pGH)基因编码区cDNA。1.0%琼脂糖电泳检测RT—PCR产物,胶回收PCR产物并通过T—A法亚克隆到pMD18-T载体中转化到DH5α E.coli,重组质粒经酶切鉴定后进行序列分析。序列分析表明,克隆得到的猪生长激素基因pGH编码216个氨基酸残基,分子量为24.4KDa,等电点为7.26;疏水氨基酸44.9%,亲水氨基酸30.6%,碱性氨基酸13.0%,酸性氨基酸11.6%。其1-26aa为pGH信号肽序列,27—216aa为成熟肽序列。pGH与Seeburg等(1983)报道的猪GH蛋白序列(AAA31045)的同源性为100%,与Kato等(1990)报道的猪GH相比在蛋白质序列(CAA37411)有99.1%的同源性,与Qi等(1989)和Chowdhary等(1994)报道的猪GH蛋白序列(AAA73477,NP999034)的同源性为97.7%,与Qi等(1989)报道的猪GH蛋白序列(AAA73478)的同源性为97.2%。 将已克隆的猪生长激素(pGH)基因cDNA片断定向插入VR1020质粒,转化大肠杆菌DH5α,用菌落PCR和质粒PCR方法筛选阳性克隆;以BamH Ⅰ和EcoRⅠ酶切鉴定重组真核表达质粒VpGH。利用脂质体法介导VpGH转染哺乳动物细胞COS-7,对转染后的COS-7细胞进行RT-PCR、ELISA和免疫荧光分析,分别在转录和翻译水平证实了目的基因在COS-7细胞中得到正确转染表达。本研究为进一步开展猪生长激素的真核表达质粒在动物中的转染表达和生物活性检测及研制新型调节猪生长的基因制剂奠定了基础。
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