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目的:肌萎缩侧索硬化症(Amyotrophic Lateral Sclerosis,ALS)是中枢神经系统变性病,主要累及脊髓前角、脑干后组运动神经核以及锥体束,以上、下运动神经元同时受损为特征。临床常以单肢远端肌无力、萎缩为首发症状,逐渐累及其他肢体。上运动神经元受累表现为腱反射活跃、病理反射阳性;下运动神经元受累表现为远端肌无力、萎缩。感觉和括约肌功能一般不受影响。近年来ALS确切发病机制未明确,目前研究认为发病机制相关因素如下:遗传因子突变;兴奋性氨基酸毒性增高;神经丝(neurofilament,NF)异常聚集;线粒体功能障碍;神经营养因子(neurotrophic factor,NTF)失调;蛋白质聚集体等。众多研究发现ALS发病与运动神经元凋亡有关,本研究主要目的是探讨ALS肌纤维萎缩与凋亡之间的关系。运动神经元病变导致骨骼肌失神经支配,出现特征性病理变化----小角化肌纤维、肌纤维肥大、分裂肌纤维、萎缩肌纤维成小群分部、核聚集、靶状纤维、RRF(Ragged Red Fiber)、肌纤维类型群化或肌纤维优势。大量的国内外研究证实失神经支配后骨骼肌肌纤维与细胞凋亡相关。ALS肌纤维中存在RRF,肌膜下线粒体聚集,显著的COX、SDH、NADH-TR酶学改变,说明ALS存在线粒体功能异常及氧化损伤现象,由此推测ALS线粒体功能障碍引起肌细胞凋亡可能是肌纤维萎缩的病理、生理学基础。磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)是磷脂激酶家族中的一个重要成员,PI3K活化产生的细胞膜类脂产物3,4-二磷酸磷脂酰肌醇[PI(3,4)P2]和3,4,5-三磷酸磷脂酰肌醇[PI(3,4,5)P3]是细胞内重要的第二信使,它们能激活下游一系列蛋白激酶如Akt/PKB (protein kinase B,蛋白激酶B),PKC(protein kinase C,蛋白激酶C)和PKA(protein kinase A,蛋白激酶A),由此导致信号的进一步转导,参与细胞的增殖、分化、凋亡和葡萄糖转运等多种细胞功能的调节。本研究通过对ALS活检骨骼肌组织化学及酶学染色病理分析;ALS肌纤维透射电镜超微结构变化分析;抗-PI3K免疫组织化学染色肌纤维表达情况的分析,探讨ALS肌纤维的凋亡机制。方法:选择31例ALS患者作为研究对象,诊断标准符合2001年中华医学会神经病学分会ALS的诊断标准----参照世界神经病学联盟(World Federation of Neurology,WFN)的诊断标准。全部患者行开放式肱二头肌活检,冰冻切片,组织化学及酶学染色(HE、GT、COX、NADH-TR、SDH、ATPase),抗-PI3K、NCAM单克隆抗体免疫组织化学染色,光学显微镜下分析细胞形态学改变及PI3K、NCAM在肌纤维的表达。部分患者活检骨骼肌经处理后(方法详见研究论文)透射电镜下分析肌纤维超微结构变化。结果:1 ALS骨骼肌组织化学及酶学染色病理分析:ALS患者活检骨骼肌病理分析共同特点如下:明显肌纤维大小不一,变性肌纤维散在,坏死、再生肌纤维少见;大量小角化肌纤维散在于肌束间,萎缩肌纤维群化,典型的核聚集现象,常见肌纤维肥大、分裂现象,结缔组织不同程度增生;部分患者改良GT染色可见肌膜下嗜碱性颗粒聚集,偶见RRF;ATPase染色肌纤维类型群化或优势;NADH-TR、SDH、COX酶染色胞浆中局灶性酶活性减低,可见典型靶状纤维、虫噬纤维。2 ALS骨骼肌免疫组织化学染色病理分析:抗-PI3K、NCAM(neural cell adhesion molecule,神经细胞粘附分子)单克隆抗体免疫组化染色,分析PI3K、NCZM在ALS肌纤维中表达,PI3K在萎缩肌纤维膜上呈阳性表达,而NCAM在萎缩肌纤维中阴性表达。3 ALS骨骼肌电镜下超微结构病理改变分析:透射电镜超微结构观察:变性肌纤维中肌节结构不清,粗细肌丝排列无序,局部肌丝呈灶状溶解,Z线呈轻度水纹状或排列不齐,肌原纤维间充填大量糖原颗粒和变性线粒体,线粒体肿胀、膜嵴融合,可见空泡化线粒体。结论:1 ALS活检骨骼肌病理分析:肌纤维膜下线粒体聚集、RRF,氧化酶(COX、SDH、NADH-TR)活性异常,而这些酶在细胞氧化过程中均为线粒体呼吸酶系的关键酶,提示ALS肌纤维中的线粒体氧化代谢障碍。2 PI3K是PI3K/Akt凋亡途径重要信号,而PI3K在ALS萎缩肌纤维膜上显著表达,NCAM在萎缩肌纤维表达呈阴性,说明萎缩肌纤维不具备变性肌纤维的特点,提示ALS萎缩肌纤维可能是凋亡的肌细胞。3透射电镜下超微结构观察结果提示萎缩肌纤维中存在典型的线粒体形态异常改变,而ALS患者病理未见明显的肌纤维坏死,推测线粒体可能与肌细胞凋亡有关。