世界范围内,肝细胞肝癌(Hepatocellular carcinoma, HCC)的发病率位居常见肿瘤的第五位,每年有近六十万人死于这一恶性肿瘤。肝炎病毒感染、酗酒、以及黄曲霉毒素B1的摄入,是导致HCC的主要原因。临床上针对非肝硬化HCC和肝硬化HCC患者分别采取肝切除和肝移植的治疗手段。然而,在HCC发生的初始阶段,病人一般无明显症状,同时HCC的转移率非常高,这已成为临床上治疗HCC的极大障碍。因此,加强HCC肿瘤发生和转移的分子机理研究,对于预防和治疗HCC至关重要。Clorf61(1号染色体开放阅读框61)基因的开放阅读框(open reading frame,ORF)由468个碱基组成,该基因编码的全长蛋白包括156个氨基酸,分子量约为17.2kDa。有关Clorf61的最初报道认为,该基因可能通过c-Fos信号途径参与了大脑形成时细胞重塑过程。我们的前期研究发现,在人类胚胎发育的4至9周,Clorf61表达水平迅速上升,而4至9周是大多数器官发育形成的关键时期。Clorf61参与了胚胎发育过程中,包括椎骨和四肢骨在内的骨骼系统的形成。肿瘤生物学研究中,最近提出了一种新理论：肿瘤的形成和生长是由肿瘤组织中的肿瘤干细胞(肿瘤起始细胞)所维持。已有研究表明,从肝细胞肝癌细胞系Iuh7和PLC8024中分离出来的CD133+肿瘤干细胞,其Clorf61的表达高于对照组细胞(CD133-细胞)。而在一系列人体组织中调查Clorf61的表达谱,发现在正常肝组织中检测不到Clorf61的表达信号。Clorf61在染色体上定位于1q22,1q22是人类HCC中染色体扩增高发区。然而,Clorf61基因在HCC组织中的表达及其在HCC发生发展中的作用仍不清楚。本研究中,我们检测了不同临床样品(正常肝脏、肝炎、肝硬化、和HCC样本等)中Clorf61的表达情况。研究发现,Clorf61的表达与肝脏疾病进展相关。与正常肝组织比较,Clorf61蛋白在肝硬化组织中表达上调,在HCC肿瘤中表达进一步升高。此外,HCC患者中,HBV阳性组其Clorf61表达显著高于HBV阴性组(P<0.05)。我们还检测了Clorf61在肝癌细胞株HepG2(没有整合HBV基因组)和HepG2.2.15(HBV基因组稳定整合)中的表达。结果表明,HepG2.2.15细胞中Clorf61的表达明显高于HepG2细胞。此外,恶性化程度较高的肝癌细胞株BEL7402和Huh7具有较高的Clorf61蛋白表达,而恶性程度较低的肝癌细胞株FHCC98表现为中等程度的Clorf61蛋白表达。Clorf61蛋白主要定位于细胞质中。在人肝细胞系L02中过表达Clorf61基因,能促进细胞增殖和克隆形成。我们采用PI染色及流式细胞仪分析细胞周期,研究表明,过表达Clorf61会导致S期细胞比例增加,同时G1期细胞比例减少。利用Western blotting分析细胞周期相关蛋白的表达,结果显示,与L02-GFP细胞相比,L02-GFP-Clorf61细胞中细胞周期蛋白E1(Cyclin E1),细胞周期蛋白D1(Cyclin D1),细胞周期蛋白D3(Cyclin D3)和周期蛋白依赖性激酶2(CDK2)表达升高。此外在伤口愈合实验中,划痕产生36小时后,L02-GFP-Clorf61细胞伤口愈合速度明显快于L02-GFP细胞,表明C1orf61增强了细胞的横向迁移能力。另外,我们采用Transwell小室/侵袭小室以研究细胞迁移/侵袭。结果表明,与对照组相比,过表达Clorf61增强了细胞迁移和侵袭能力(P<0.01)。上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)是与肿瘤侵袭和转移相关的重要分子机制。在L02细胞中过表达Clorf61后,观察到上皮细胞标志物钙粘附蛋白E-cadherin和紧密连接蛋白occludin表达水平下调。与L02-GFP-Clorf61细胞相比,L02-GFP细胞的问充质细胞标志物N-钙粘附蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(vimentin)、和转录因子snail的表达相对较低。免疫荧光实验印证了Western blotting结果,即L02-GFP-Clorf61细胞中E-钙粘附蛋白的下调和波形蛋白的上调。发生EMT的细胞,一个重要特征是细胞扩散速度增加。研究发现L02-GFP细胞紧密相连、呈均匀鹅卵石状,而L02-GFP-Clorf61细胞呈现纺锤形、成纤维问质细胞形态。此外,异硫氰酸(罗丹明)标记的鬼笔环肽染色也显示,L-02-GFP-C1orf61细胞形成了丝状伪足,这与细胞形态的改变是一致的。综上所述,本研究表明,Clorf61基因在HCC组织中的表达普遍高于正常肝组织。HCC患者中,Clorf61在HBV感染阳性组的表达高于HBV感染阴性组。Clorf61通过促进细胞增殖和克隆形成,增强细胞运动和侵袭能力,诱导EMT发生,从而可能在HCC肿瘤发生及转移过程中发挥着重要作用。我们的研究首次证明了,Clorf61可能在HCC肿瘤发生和转移过程中扮演了重要角色。