喉鳞癌排在头颈部恶性肿瘤第三位。喉癌外科治疗历史已有100多年,但对于晚期患者和复发后失去手术机会的患者,在常规手术治疗或综合治疗均不能带来明显益处的时候,或者为了保全喉功能,而不愿意牺牲喉器官的时候,放化疗就显得尤为重要。但是目前临床上所使用的很多抗癌药物在治疗过程中会引起患者恶心、呕吐、骨髓抑制、免疫力下降、毛发脱落,胃肠道功能降低等众多不良反应,患者在治疗过程中往往无法承受这些副作用而中止治疗。因此,如何减少这些抗癌药物对人体的毒副作用,增加抗肿瘤药物的疗效成为当前迫切的任务和研究热点。肿瘤靶向治疗的研究应运而生,这种方法能够根据肿瘤所表达的特殊抗体或配体选择性地将抗药物或基因运送到被识别出来的部位,并在一定外力条件或自身性质改变条件下将药物或基因释放出来,减少在全身循环中滞留的时间,从而减少全身不良反应,提高疗效。随着超声造影剂的不断深入研究,以携带特定配体为特点的靶向超声造影技术使具有靶向作用的微泡能够识别并结合靶点,通过血液聚集到我们希望观察的组织或器官,并在靶组织或靶器官部位特异性显影。超声分子造影剂作为治疗药物载体的肿瘤靶向诊断与治疗成为研究热点,为喉鳞癌的治疗提供了新的思路。肿瘤的生长依赖于肿瘤新生血管为它提供所需的一切营养物质。目前发现与肿瘤血管生成相关的因子大约有30多种。其中血管内皮生长因子(VEGF)及其受体在肿瘤血管生成过程中起着非常重要的作用。随着对喉鳞癌细胞及分子生物学机制研究的不断深入,促血管生成因子的分子靶向治疗为晚期喉鳞癌、喉鳞癌术后复发及转移的患者提供了新的治疗方式。紫杉醇是从红豆杉属植物紫杉的树干、树皮或针叶中提取开发得到的一种抗微管药物。目前,PTX已被纳入晚期头颈部鳞癌器官保全性治疗方案中。脂质微泡因其具有易分解、安全性好、对人体无害等优点已被广泛作为药物或基因载体用于肿瘤治疗等领域,靶向脂质微泡是在其表面连接有针对特异性抗原的抗体或针对特异性受体的配体,可以有选择性地到达相应的组织或器官,并与之结合,使药物或基因靶向地局部释放,实现靶组织或靶器官的精确治疗,减少全身循环中的滞留,从而减少全身毒副作用。本实验中就是利用超声微泡载紫杉醇,并使其具有主动靶向作用,有针对性的对细胞所表达的特异性受体作用,从而达到精确治疗的目的。在本实验中,我们利用靶向超声分子探针制备技术和生物素-亲和素方法将VEGF与载PTX药物微泡连接,检测VEGF靶向载PTX脂质微泡的抗体连接情况和理化性质,研究靶向载药微泡与喉鳞癌细胞的靶向结合能力,并通过细胞学实验和动物模型研究VTPLLM结合超声靶向微泡破裂技术对喉鳞癌的作用及相关机制,从而为喉鳞癌的靶向治疗和超声分子影像技术研究提供新的实验依据。本课题主要包括以下三部分内容:第一部分制备携带VEGF的靶向载PTX微泡、检测微泡形态大小以及与细胞结合能力实验目的制备一种携带VEGF的VTPLLM,检测其理化性质及与喉鳞癌Hep-2细胞结合能力。方法采用旋转蒸发+机械震荡法制备载VEGF的脂质超声微泡(PLLMs)及生物素化的脂质超声微泡(MB-BS),通过生物素-亲和素连接法将VEGF抗体连接于MB-BS表面,制备成靶向载药微泡(VTPLLMs)。采用免疫荧光法检测脂质载药微泡VEGF抗体的连接情况,观察VTPLLMs的分散度、外观形态,检测靶向载药脂质微泡的粒径大小、浓度、zeta电位、载药量、包封率等理化性质,观察其与喉鳞癌Hep-2细胞结合情况,并与非靶向的PLLMs组进行比较。结果VTPLLMs平均粒径960±20nm,平均浓度为4.07′109/ml,微泡的包封率为81.6%,平均载药量为33.2%,免疫荧光法检测发现VTPLLMs表面有绿色环状荧光分布,在与喉鳞癌Hep-2细胞结合实验中发现靶向载药微泡组Hep-2细胞周围有多个呈绿色荧光的VTPLLMs微泡紧密结合,而对照组喉鳞癌Hep-2细胞周围未发现绿色荧光粘附。结论成功制备了携带VEGF的VTPLLMs,该微泡能够与Hep-2细胞牢固结合。VTPLLMs有望成为一种新型、高效的喉鳞癌靶向药物载体。第二部分携带VEGF的靶向超声微泡联合UTMD对喉鳞癌Hep-2细胞的增殖、凋亡、细胞周期的影响目的研究VTPLLMs联合UTMD对喉鳞癌细胞Hep-2的增殖抑制、细胞周期阻滞和诱导细胞凋亡的作用,以及Caspase-3、MMP-9、和VEGF的蛋白表达水平和mRNA表达的影响。方法按照《实用细胞培养技术》中所提供的方法培养人喉鳞癌Hep-2细胞,并选取生长状态相似的细胞随机分为6组,分别标记为:对照组(Con)(该组中细胞不做特殊处理,正常培养,加处理因素时加入PBS),携带VEGF的靶向载PTX微泡+超声辐照组(VTPLLMs+US),单纯紫杉醇药物组(PTX),紫杉醇+超声辐照组(PTX+US),空白微泡+US组(MB+US),载PTX微泡+超声辐照组(PLLMs+US)。在本部分实验中我们采用MTT检测PTX对Hep-2细胞的抑制情况;CCK-8法检测各种处理因素对Hep-2细胞的毒性作用;流式细胞术检测各种处理因素对Hep-2细胞的周期阻滞情况及诱导细胞凋亡的情况;PCR及Western Blot分别检测各组处理组Hep-2细胞的Caspase-3、MMP-9和VEGF的mRNA和蛋白表达情况。结果在MTT实验中发现,随着药物浓度增加,Hep-2细胞增殖抑制增加;相同药物浓度下,随着培养时间的延长,Hep-2细胞增殖抑制率升高,表现出明显的时间和浓度效应关系。在CCK-8法检测细胞毒性实验中发现:6个实验组中,VTPLLM+US组对喉鳞癌Hep-2细胞的增殖抑制作用最强(p<0.05);流式细胞分析检测中发现:与其他各处理组进行比较,VTPLLMs+US组对喉鳞癌Hep-2细胞的凋亡诱导作用最强(p<0.01),其将喉鳞癌Hep-2细胞周期阻滞于G2/M期的比例最高;同时该组的Caspase-3的mRNA和蛋白表达水平明显增高(p<0.01),MMP-9和VEGF的mRNA和蛋白表达水平明显降低(p<0.01)。结论VTPLLMs对喉鳞癌Hep-2细胞的生长、增殖有较为明显的抑制作用,VTPLLMs能够将喉鳞癌Hep-2细胞周期阻滞于G2/M期,并诱导喉鳞癌细胞发生凋亡,通过比较分析,和非靶向的PLLMs以及单纯PTX相比较,VTPLLMs的作用要明显强得多。其作用机制可能与凋亡执行相关的Caspase-3、MMP-9和VEGF的mRNA和蛋白表达有关。第三部分携带VEGF的靶向载药微泡联合UTMD对裸鼠喉鳞癌移植瘤作用和机制的实验研究目的研究VTPLLMs联合UTMD对裸鼠喉鳞癌移植瘤的治疗作用和相关机制方法建立裸鼠喉鳞癌皮下移植瘤模型,实验随机分为5组,分别是:空白对照组(Con),PTX组(PTX),PTX联合超声组(PTX+US),载PTX微泡联合超声组(PLLMs+US),VEGF靶向载PTX微泡联合超声组(VTPLLMs+US)。测量治疗前后各组肿瘤长短径,绘制裸鼠肿瘤的生长曲线,并计算肿瘤抑制率,TUNEL法检测各处理组细胞的凋亡情况,免疫组织化学染色法检测肿瘤组织MMP-9和VEGF的表达,实时定量荧光PCR及Western Blot分别检测各组Caspase-3、MMP-9和VEGF的mRNA和蛋白表达情况。结果各处理组相比较,VTPLLMs+US组对裸鼠喉鳞癌的抑制率最高,其凋亡指数明显高于其他组(p<0.01),增殖指数明显降低(p<0.01),MMP-9和VEGF的表达水平明显低于其他各组(p<0.01)RT-PCR和WB结果显示:VTPLLMs+US组Caspase-3的mRNA和蛋白表达水平明显增高(p<0.01),MMP-9和VEGF的蛋白水平明显低于其他各组(p<0.01)。结论VTPLLM对裸鼠喉鳞癌的生长有明显抑制作用,抑瘤作用强于非靶向的PLLMs和PTX,作用机制与能够更强的抑制裸鼠肿瘤微小血管生成和浸润转移、上调Caspase-3,下调VEGF和MMP-9表达水平有关。VTPLLMs联合UTMD具有比非靶向载药微泡以及单纯药物治疗更加有效的喉鳞癌靶向作用和更强的抗肿瘤作用,为喉鳞癌的靶向治疗提供了依据。