近年来,食品安全问题频发。大肠杆菌O157：H7等食源性致病菌已成为危害食品安全的主要杀手,如何快速而准确地检测这些致病菌,是有效遏制这些杀手、确保食品安全的首要任务。电化学生物传感器是一种快速检测致病菌的方法。电化学测试方法中的电化学阻抗谱(Electrochemical impedance spectroscopy,EIS)技术在研究快速低成本、非标记和非侵入式的生物检测方法中具有巨大的应用潜力,而且阻抗法在研制小型化、易操作的电子检测装置中具有明显优势。但是目前检测所用电极较贵、而且重现不是很理想,阴、阳性电信号响应曲线的离散度不够明显,仅限于实验室阶段,商业化产品较少。因此急需发展成本更低、实用性更强、操作更简便的“用户友好型”生物传感器。本论文针对电化学生物传感器在食品安全快速检测中出现的难点问题,在原有基本原理的基础上,结合丝网印刷技术、纳米材料等,在传感器的电极、生物分子固定、信号处理等方面进行了改进和创新。构建了几种不同生物传感器,并分别通过对大肠杆菌O157：H7、布鲁氏菌感染,以及多种菌感染导致的牛奶体细胞上升、牛奶质量下降等食品安全问题的检测,初步证实了这些技术用于食品安全快速检测的可行性。主要研究结果如下：(1)将EIS技术和免疫层析技术相结合,利用丝网印刷技术和纳米材料,研制了基于聚苯胺标记的一次性免疫层析试纸条,解决了免疫层析试纸条灵敏度偏低、只能定性检测等不足。首先合成了三种质子酸掺杂的聚苯胺,其中聚苯乙烯磺酸(PSSA)掺杂合成的聚苯胺溶解度为0.37g,相应电导率为2258.8μs/cm,性能优于另两种酸的产物。选用导电性和溶解性最优的PSSA掺杂制取的聚苯胺标记抗体,丝网印刷技术制作电极,组装研制了快速检测大肠杆菌O157：H7的免疫层析试条,并验证了该试纸条快速定性检测大肠杆菌O157：H7的可行性。结果表明,丝网印刷电极均一性良好,构建的传感器在滴加样品180秒后免疫反应达到平衡；当频率小于100Hz时,空白液和有菌液样品的阻抗区别较大,并且有菌液的总阻抗小于空白液,初步实现了对大肠杆菌O157：H7的快速定性检测。(2)在定性检测的基础上,通过对多频阻抗数据的分析,进一步研究了使用免疫试纸条定量检测大肠杆菌O157：H7。实验发现免疫反应达到平衡后,大肠杆菌浓度在1.15×103～1.15×106CFU/mL范围内与1Hz频率处的总阻抗变化率NICz呈良好的线性关系。最低检测限为7.08×102CFU/mL (S/N=3),回归函数为NICZ=0.074lZg(C)+0.0108,决定系数为0.9616,具有较高的灵敏度。样品测试过程包括数据采集可在六分钟内完成(试纸条的制作时间除外),速度较快,测试简便,具有进一步开发推广的价值。但最低检测限还有待进一步改善。(3)针对免疫层析试纸条检测限偏高的问题,提出了复数Td因子校正法,试图在交流信号激励减小电极极化效应的条件下,消除寄生电容的影响,提高传感器的检测精度。首先将复数Td因子校正用于“准组织”被测体(本研究特指由大肠杆菌0157：H7抗原、抗体、溶液及生物膜等构成的体系)的阻抗数据分析中,并在导纳平面内,用最小二乘法拟合Cole-Cole模型,提取Cole-Cole参数。采用逐步回归方法,优选出特征参数,建立基于Cole-Cole特征参数的大肠杆菌浓度回归模型。实验发现寄生电容对传感器的干扰随着频率的增加而增大,而且一般来说随机性较大。由于寄生电容、电极极化等因素带来的误差,使得该传感器的最低检测限偏高。利用最新提出的复数Td因子对免疫传感器的阻抗测试值进行校正,可以有效校正所有频率点的复阻抗数据,降低寄生电容的干扰；实测的多频阻纳数据经校正后能与非线性最小二乘拟合的Cole-Cole轨迹较好的吻合,而且其参数与细菌浓度关系密切,可以作为定性或定量检测的依据。利用SAS数据处理软件,采用逐步筛选法,对提取的特征参数进行筛选,最终选取参数G0、α和G02建立了多元线性回归模型,模型的相关系数为0.9792,最低检测限为38CFU/mL,检测精度有所提高。(4)首次构建了基于金纳米颗粒修饰的丝网印刷碳电极(GNPs-SPE)无标记免疫传感器,并利用电化学测试技术实现了布鲁氏菌的快速定量检测。为了分析研究电极表面的变化,提出了一个等效电路。该电路由电解液的电阻、双层电容、电子传递阻抗和Warburg阻抗四部分构成。所测阻抗数据经ZVIEW件拟合该等效电路,得到了电极在每一步组装过程中参数的变化情况。通过比较发现,所有的阻抗元件中,电子传递阻抗改变率最大。而且当布鲁氏菌纯菌液细胞浓度在4×104～4×106CFU/mL范围时,菌液浓度的对数值和电子转移阻抗变化值呈线性关系。布鲁氏菌纯菌液和牛奶真实样品的检测限分别为1×104CFU/mL、6×104CFU/mL.该免疫传感器能在1.5小时内检测出结果,与目前常用的SAT法相比,大大缩短了检测时间。而且传感器有良好的专一性,与大肠杆菌0157：H7、金黄色葡萄球菌没有交叉反应。构建的免疫传感器采用一次性丝网印刷电极,成本相对低廉,而且检测时间短,操作简单,具有进一步开发推广的价值。(5)针对多种致病菌感染导致的食品安全问题,以奶牛乳腺炎为例,设计制作了基于叉指两电极的牛奶体细胞直接快速检测传感器,结合EIS测试,深入分析了奶样的多频响应,并建立了体细胞定量检测的SVR模型。研究发现：奶样的交流阻抗电参数与奶牛乳腺炎患病程度存在一定的相关关系。随着患病程度的增加(即体细胞数的增加),Rs减小,而Q和α呈现非线性变化趋势。利用EIS电参数与支持向量回归技术建立牛奶体细胞数定量预测的方法是可行性的(除N级的奶样外)。SVR定量模型对除N级以外的其他奶样的体细胞数有较高的预测精度,平均相对误差为29.40%。SVR定量模型对1级、2级、3级的乳腺炎检出正确率均达到100%,但不适合N级奶样的预测。(6)针对两电极对N级奶样预测错误率高的问题,改进设计叉指四电极,探讨了不同叉指电极测试模式减小电极极化及寄生电容干扰。结果表明,两电极及四电极模式测试条件下,奶样阻抗值分别在频率大于10kHz及1kHz时,电阻占主导作用,是总阻抗的主要贡献者。三种测试条件下,不同奶样在高频部分阻抗值的区别大于低频部分,而且在两电极模式下,BC端测试效果好于AD端。另外,通过比较BC端在两电极和四电极模式下奶样的测试效果发现,由于四电极有效减小了电极极化、接触电阻及寄生电容等干扰,使得测试值更加接近奶样的真实值,因此,奶样的区分度明显地优于两电极。(7)探讨了基于阻抗特征频率提取的牛奶体细胞检测。利用四电极测试采集的奶样多频阻抗数据,采用逐步回归分析,从多频中选出有限频率组合,确定了11720Hz、9668Hz、8105Hz和1172Hz为特征频率,并用SVM建模方法,建立了基于特征频率阻抗的牛奶体细胞定量检测模型。该模型对N级奶样体细胞数的预测精度有一定的提高,对T级预测达到了与两电极相同的测预效果,且对2级、3级的乳腺炎检出正确率均达到100%。该方法利用了从多频率阻抗信息转化而得到的能保留原始变量绝大部分信息的几个主频率信息,从而达到了降维的目的,为家庭型牛奶体细胞快速检测仪的开发奠定了基础。