2018年世界卫生组织（WHO）报告显示,全球5.1%的疾病负担和5.3%的死亡归因于酒精滥用。长期过量饮酒引起的酒精性肝病（Alcoholic liver disease,ALD）是与酒精相关的主要慢性疾病,早期表现为可逆的肝脂肪变性,进一步发展成脂肪性肝炎、肝纤维化、肝硬化和肝癌。一旦进展至终末期肝病,目前除肝移植外尚无其它有效的治疗措施。ALD的发病机制错综复杂,多种机制交织并存。线粒体是酒精代谢的主要靶细胞器,其功能障碍在ALD的发生发展中至关重要。然而,ALD中线粒体损伤的介导机制尚不明确,因此深入研究有望为ALD的防治提供潜在的理论和实验依据。Frataxin是由核基因FXN编码并靶向定位于线粒体的铁伴侣分子,作为铁供体在铁硫簇（Iron-sulfur cluster,ISC）的组装和血红素的合成中发挥重要作用。值得注意的是,frataxin缺失相关疾病的线粒体表现与ALD典型的病理特征较为相似,如多种含ISC酶（如呼吸链复合物亚基）缺陷、铁代谢和线粒体自噬紊乱等线粒体功能障碍。课题组前期研究发现:高脂或酒精喂养小鼠肝脏frataxin表达降低,且frataxin的降低可能与高脂膳食诱导的脂质沉积以及酒精导致的铁死亡相关。以上研究揭示了frataxin在肝脏疾病中的重要作用。然而高脂诱导的肝脏铁缺乏以及酒精导致的肝铁过载这一矛盾结果使铁对frataxin的影响尚不确定。研究显示在缺乏线粒体ABC转运体Atm1（Atm1缺乏显示线粒体铁过载和胞浆铁缺乏的特征）酵母中,frataxin m RNA水平下降,提示铁可能调节frataxin表达。在去铁胺处理的弗里德赖希共济失调患者及正常对照组的成纤维细胞和淋巴母细胞中发现,frataxin m RNA和蛋白水平皆降低;反之,柠檬酸铁铵处理则明显增加frataxin的表达。以上结果表明frataxin表达与铁水平密切相关。那么,ALD模型中,frataxin是否依赖铁的调控介导线粒体损伤?这一问题仍需进一步探究。植物黄酮类化合物槲皮素广泛存在于日常水果蔬菜中,除抗氧化和抗炎作用,大量研究也显示槲皮素调节铁稳态和保护线粒体功能的作用。我们课题组前期研究表明在ALD模型中,槲皮素改善酒精诱导的肝铁过载和线粒体功能紊乱（如膜电位降低、线粒体氧化应激以及线粒体自噬抑制等）。然而,槲皮素保护ALD线粒体损伤的机制仍未完全阐明。由于frataxin在维持线粒体功能中发挥重要作用且易受铁水平的影响,槲皮素能否以铁-frataxin为切入点发挥保护线粒体的作用?此问题尚需深入研究和揭示。本研究主要内容包括以下三个部分。第一部分槲皮素对酒精诱导的小鼠肝脏线粒体功能紊乱的保护作用目的:探讨槲皮素对酒精诱导的肝脏损伤以及线粒体功能紊乱的保护效应。方法:8-9周龄、18-20 g的雌性C57BL/6N小鼠70只,随机分为对照组、酒精组、酒精加槲皮素组、槲皮素组。酒精组采用乙醇供能28%的Lieber De Carli液体饲料喂养12周,并在最后一天灌胃（酒精组灌胃5%的酒精）建立慢加急ALD模型,对照组和槲皮素组等能量配对喂养不含酒精的正常Lieber De Carli液体饲料,槲皮素以饲料添加方式进行干预（剂量相当于100 mg/kg.bw）。检测血清谷丙转氨酶（ALT）和谷草转氨酶（AST）水平;观察肝脏组织病理学表现（苏木素-伊红染色和油红O染色）;转录组学技术检测肝脏差异基因表达水平;JC-1探针评估小鼠肝脏线粒体膜电位水平;透射电镜观察线粒体超微结构;western blot检测线粒体自噬、线粒体呼吸链复合物以及线粒体铁代谢和铁利用相关蛋白表达。结果:1.1槲皮素对酒精诱导的小鼠肝功能损伤的保护作用与对照组相比,酒精组小鼠血清ALT和AST水平明显上升（P<0.05）。苏木素-伊红染色发现酒精组小鼠肝组织结构紊乱,肝细胞之间界限模糊。油红O染色显示慢加急酒精喂养小鼠的肝脏出现大量脂滴蓄积。槲皮素干预明显降低酒精组血清ALT和AST水平（P<0.05）,并改善肝组织病理损伤。1.2槲皮素对慢加急酒精喂养小鼠肝脏基因表达的影响:基于转录组学结果酒精组与对照组共5750个差异基因;酒精加槲皮素组与酒精组共950个差异基因;且在以上两个比较组中发现844个共同差异基因。细胞组分分析显示差异基因变化最明显的细胞器是线粒体,基因富集结果主要体现在活性氧的解毒、线粒体自噬、氧化磷酸化、三羧酸循环和呼吸电子传递以及线粒体呼吸链复合体的组装等过程。1.3槲皮素对酒精诱导的小鼠肝脏线粒体功能紊乱的保护作用与对照组相比,酒精组小鼠肝脏的线粒体超微结构异常（线粒体嵴肿胀、断裂、消失,部分线粒体空泡化）;线粒体膜电位降低（P<0.05）;线粒体复合物I和II蛋白表达降低;自噬相关蛋白LC3II以及线粒体自噬蛋白PINK1、Parkin和Bnip3水平明显降低（P<0.05）,自噬受体蛋白p62、线粒体蛋白TOM20和VDAC1表达增加（P<0.05）;槲皮素干预明显改善慢加急酒精喂养小鼠肝脏线粒体形态结构、上调线粒体膜电位水平（P<0.05）并增加线粒体呼吸链复合物和线粒体自噬相关蛋白的表达（P<0.05）。1.4槲皮素对酒精诱导的小鼠肝脏线粒体铁代谢和铁利用相关蛋白的影响与对照组相比,酒精诱导线粒体铁转入相关蛋白MFRN2和亚铁鳌和酶（FECH）水平升高,抑制ATP结合盒式亚家族B成员10（ABCB10）表达（P<0.05）;槲皮素干预则明显缓解上述蛋白表达水平的紊乱。结论:槲皮素缓解酒精诱导的小鼠肝脏线粒体功能紊乱,可能与其改善线粒体铁代谢和铁利用障碍有关。第二部分槲皮素上调frataxin改善酒精诱导的肝细胞线粒体功能紊乱目的:明确酒精对frataxin的影响,并进一步探究frataxin在酒精诱导的肝细胞线粒体功能紊乱中的作用及槲皮素的保护效应。方法:2.1动物模型同第一部分,western blot检测小鼠肝脏frataxin蛋白表达。2.2应用TMTTM标记的定量蛋白质组学技术检测Lv-empty空载组和Lv-FXN沉默组的差异蛋白:根据FXN基因设计沉默frataxin蛋白的干扰序列,制备慢病毒载体并感染Hep G2,分别构建Lv-empty空载组和Lv-FXN沉默组。2.3探讨酒精对frataxin的抑制作用:（1）以Hep G2为研究对象,酒精（100 m M）、促氧化剂4-羟基壬烯醛（4-HNE）和抗氧化剂N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC）单独或联合处理。（2）进一步以过表达酒精代谢酶CYP2E1的Hep G2CYP2E1+/+为研究对象,分为对照组和酒精组。检测frataxin蛋白表达。2.4探究frataxin在酒精诱导的肝细胞线粒体功能紊乱中的作用及槲皮素的保护效应:酒精和槲皮素（50μM）单独或联合处理过表达CYP2E1的Lv-empty和Lv-FXN Hep G2CYP2E1+/+细胞,JC-1探针评价线粒体膜电位水平;线粒体（Mitotracker）与溶酶体（Lysotracker）探针的荧光共定位衡量线粒体自噬水平;线粒体二价铁荧光探针（RPA）观察线粒体铁水平;检测线粒体自噬相关蛋白的表达。结果:2.1酒精对小鼠肝脏frataxin表达的影响:ALD动物模型中,与对照组相比,酒精抑制小鼠肝脏frataxin蛋白表达（P<0.05）。2.2蛋白质组学结果:Lv-FXN沉默组与Lv-empty空载组相比,共计285个差异蛋白,其中有20种特异性定位于线粒体,在功能分布方面差异蛋白主要参与线粒体生物合成、氧化磷酸化以及线粒体铁利用等。此外,蛋白组学结果提示frataxin缺乏导致VPS33A、GABARAPL1和GABARAPL2等自噬相关蛋白的紊乱。2.3酒精对线粒体功能的影响及frataxin的介导效应2.3.1与对照组相比,酒精处理Hep G2 12 h和24 h增加frataxin蛋白表达,48h和72 h则降低frataxin水平（P<0.05）。NAC干预缓解酒精（72 h）对Hep G2中frataxin表达的抑制（P<0.05）;相反地,与酒精组相比,4-HNE进一步降低frataxin表达。2.3.2酒精孵育（12-48 h）Hep G2CYP2E1+/+降低frataxin蛋白水平（P<0.05）。2.3.3与对照组相比,酒精抑制Lv-empty Hep G2CYP2E1+/+细胞线粒体膜电位水平;frataxin的缺乏进一步加剧酒精的抑制作用（P<0.05）。2.3.4与对照组相比,酒精降低Lv-empty Hep G2CYP2E1+/+细胞线粒体自噬水平,并诱导LC3II、Beclin1以及Bnip3蛋白水平的下降以及线粒体蛋白TOM20和VDAC1表达的上调;frataxin的缺乏进一步加剧酒精对线粒体自噬的抑制作用（P<0.05）。2.4槲皮素对线粒体的保护作用及frataxin的介导效应2.4.1 ALD动物模型中,槲皮素干预明显改善酒精对frataxin表达的抑制作用（P<0.05）。同样的,槲皮素增加酒精诱导的Hep G2CYP2E1+/+中frataxin水平的降低（P<0.05）。2.4.2与酒精处理的Lv-empty Hep G2CYP2E1+/+细胞相比,槲皮素上调线粒体膜电位和线粒体自噬水平并降低线粒体铁水平增加;而frataxin沉默则显著降低槲皮素的保护效果（P<0.05）。结论:体内外研究表明酒精抑制frataxin的蛋白表达。进一步发现槲皮素通过上调frataxin缓解酒精诱导的肝线粒体功能紊乱。第三部分槲皮素调节铁水平恢复frataxin表达拮抗酒精对线粒体的损伤目的:以可变铁池（Labile iron pool,LIP）为核心,探讨槲皮素诱导frataxin表达是否与铁水平有关。方法:3.1动物模型同第一部分。火焰原子吸收法检测动物小鼠肝脏LIP水平;普鲁士蓝染色评价肝组织三价铁水平;western blot检测肝脏铁代谢相关蛋白以及铁噬相关蛋白表达;免疫荧光染色（NCOA4和FTH共定位）观察铁噬水平。3.2探究槲皮素对frataxin的影响是否与铁水平有关:（1）去铁酮（DFP）、柠檬酸铁铵（FAC）、酒精以及槲皮素单独或联合处理Hep G2CYP2E1+/+、Lv-empty和Lv-FXN Hep G2CYP2E1+/+细胞。（2）酒精和3-O甲基化槲皮素处理Hep G2CYP2E1+/+。（3）设计NCOA4 si RNA,处理酒精和槲皮素孵育的Hep G2CYP2E1+/+。JC-1探针评估线粒体膜电位水平;二价铁离子探针（Ferro Orange）衡量细胞LIP水平;检测frataxin蛋白表达。结果:3.1槲皮素对慢加急酒精喂养小鼠肝脏铁水平的影响酒精组与对照组相比,小鼠肝脏LIP水平、FTL蛋白表达以及三价铁水平增加（P<0.05）,铁代谢相关蛋白Tfr1、DMT1和FPN表达增加（P<0.05）,IRP1和hepcidin表达降低（P<0.05）。槲皮素干预降低慢加急酒精喂养小鼠肝脏LIP、FTL蛋白及三价铁水平的升高,改善铁代谢相关蛋白的紊乱。3.2铁对frataxin蛋白表达的影响及槲皮素作用3.2.1与对照组相比,FAC和DFP分别降低或增加Hep G2CYP2E1+/+中frataxin蛋白表达,且呈现剂量依赖关系。同样的,DFP显著增加Lv-FXN Hep G2CYP2E1+/+细胞中frataxin的表达（P<0.05）。3.2.2酒精处理的Lv-empty和Lv-FXN Hep G2CYP2E1+/+细胞中,槲皮素增加frataxin表达;FAC则明显抑制槲皮素对frataxin的诱导作用（P<0.05）。3.3槲皮素调控frataxin蛋白表达的机制3.3.1 Hep G2CYP2E1+/+中,酒精增加LIP水平并抑制frataxin蛋白表达;3-O甲基化槲皮素对酒精增加的LIP水平以及抑制的frataxin蛋白表达无影响（P<0.05）。3.3.2与对照组相比,酒精抑制小鼠肝脏NCOA4表达并增加FTH的水平,降低NCOA4和FTH的共定位;槲皮素干预改善上述蛋白的紊乱并增加NCOA4和FTH的共定位。进一步在酒精处理的Hep G2CYP2E1+/+中发现,槲皮素上调frataxin表达和线粒体膜电位水平;沉默NCOA4则降低槲皮素的增加作用（P<0.05）。3.3.3与酒精和槲皮素联合处理的Hep G2CYP2E1+/+相比,FAC降低槲皮素对线粒体膜电位的保护效应（P<0.05）。结论:Frataxin表达被铁水平调控。进一步研究发现槲皮素可能通过调节铁水平（螯合铁和NCOA4介导）增加frataxin表达,缓解线粒体功能紊乱。