背景：　　在我国，缺血性心脏病的发病率逐年上升，严重危害人民群众健康。冠状动脉粥样硬化导致的动脉狭窄或闭塞是引起缺血性心脏病最主要的原因。通过经皮冠状动脉腔内血管成形术或冠状动脉搭桥术迅速恢复心肌供血是治疗缺血性心脏病的关键。但是，冠状动脉再灌注常常导致心功能不全，包括心律失常，微血管损伤，心肌细胞死亡等，临床上把这种现象称为心肌缺血/再灌注损伤。抑制心肌缺血/再灌注损伤是续解除冠状动脉狭窄或阻塞后，缺血性心肌病重要的治疗策略。因此，开发安全、高效的防治心肌缺血/再灌注损伤的药物具有十分重要的临床意义。流行病学调查发现缺血性心脏病的发生、发展及预后与性别存在明显的相关性。男女体内激素水平特别是性激素水平不同是导致缺血性心脏病存在性别差异的最主要原因。雌激素是女性体内一种非常重要的性激素。实验室研究已证实雌激素对心肌缺血损伤有保护作用，但是，在雌激素替代疗法治疗冠心病的临床研究中，雌激素并没有表现出令人惊喜的心肌保护作用，这导致人们对雌激素是否具有心肌保护作用产生较大争论。因此，深入探讨雌激素心肌保护效应和相关分子机制是解决上述争论迫切需要的。　　GPER1是目前唯一被广泛认可的雌激素相关膜受体。GPER1的发现为研究雌激素心肌保护效应，提供了一个新的靶点。当前，已有研究显示GPER1在人体和动物心脏高表达，并且GPER1的表达量明显高于雌激素α和β两个核受体。活化GPER1能够缩小心肌梗死面积，提高心脏功能。在敲出GPER1基因的小鼠中，雌激素失去对缺血心肌的保护作用。这些研究提示GPER1在雌激素介导的缺血心肌保护中起着决定性的作用。当前，人们对于GPER1心肌保护效应的观察并不全面，对于GPER1如何参与心肌保护作用的分子机制尚不清楚。这些都成为以GPER1为靶点开发安全、高效的防治心肌缺血/再灌注损伤药物的“绊脚石”。氧化应激是缺血/再灌注导致心肌损伤的重要原因。因此，本研究采用双氧水（H2O2）处理心肌细胞建立心肌氧化损伤模型，全面观察GPER1对大鼠心肌细胞氧化损伤的保护作用，并探讨相关分子机制。本研究旨在为以GPER1为靶点研制防治心肌缺血/再灌注损伤药物提供理论依据和实验基础。同时，本研究的完成也深化了我们对雌激素心肌保护机制的认识。　　目的：　　1、明确GPER1对H2O2导致的心肌细胞损伤的保护作用，并探讨GPER1介导心肌保护的能力与它被活化程度以及被活化时间点的关系。　　2、观察GPER1能否抑制H2O2导致的心肌细胞凋亡，并进一步探讨GPER1通过活化Akt，抑制ASK1-MKK3/6-p38信号通路，最终抑制细胞凋亡的机制。　　3、观察 GPER1能否抑制心肌细胞氧化应激，并进一步探讨 GPER1通过活化Akt，上调Nrf2表达，提高心肌细胞抗氧化能力，从而抑制细胞氧化应激的机制。　　方法：　　1、新生SD雄性大鼠心肌细胞的分离和培养在无菌条件下迅速取出新生SD雄性大鼠心脏，除去心房和大血管，获得心室，将心室剪碎成约1-2 mm3小块；加入0.1％胶原酶室温消化10 min，然后加入培养基（含10%胎牛血清的高糖DMEM）终止消化，静止片刻收集细胞悬液，按上述步骤重复消化心室组织碎块3次。收集细胞悬液，用200目筛网过滤，然后1000转/min，离心5 min，去除上清液，培养基（含10%胎牛血清的高糖DMEM）重悬沉淀，转入培养瓶中，细胞孵箱内培养30 min，去除成纤维细胞。轻轻反转培养瓶，小心吸出细胞混悬液，接种于培养皿中，入细胞孵箱内培养（培养条件：37℃，5%CO2）。隔天换1次液，培养3-4天后使用。　　2、实验分组将原代培养心肌细胞分为4个大组，正常组，H2O2处理组， G1处理组，G1+抑制剂组（G15或LY294002）处理组。后三个组根据实验设计又分为若干个小组。在H2O2处理心肌细胞建立氧化损伤模型实验中，根据处理细胞H2O2浓度（400-1200μM），细胞分为：400μM，600μM，800μM，1000μM，1200μM共五个组。在观察 GPER1对心肌细胞氧化损伤保护作用的研究中，G1处理组根据给药时间，分为H2O2处理前1h组，H2O2处理后20 min和H2O2处理后1h组；G1处理组根据给药浓度，分为1,4,6,8,10 nM五组。在GPER1心肌保护机制研究中，G1处理组给药时间为H2O2处理前1h；给药浓度：8 nM。抑制剂G15和LY294002给药时间为给予G1前1h，给药浓度：G15(100 nM)和 LY294002(10μM)。　　3、心肌cTnT和GPER1免疫荧光双标染色心肌细胞爬片用4℃，4%多聚甲醛在室温固定20min。然后，5%山羊血清室温孵育30 min，0.5%Triton X-100室温孵育15 min，用抗cTnT抗体（抗体浓度1:100）4℃条件下孵育细胞过夜。PBS缓冲液洗涤三次，用Cy3（红色荧光）标记的二抗37℃条件下孵育细胞2 h。PBS缓冲液洗涤三次，用抗GPER1抗体（抗体浓度1:100）4℃条件下孵育细胞过夜。PBS缓冲液洗涤三次，用FITC（绿色荧光）标记的二抗37℃条件下孵育细胞2 h。最后，DAPI染色液室温孵育细胞10 min。防荧光淬灭封片剂封片。激光共聚焦显微镜下观察细胞的染色情况。　　4、心肌细胞细胞活力检测（MTT法）将心肌细胞以1×104个/孔的密度接种于96孔板中，每组4个复孔，每孔培养基180μl，置于37℃，5%CO2孵箱中24h。按实验要求处理心肌细胞后，在培养基中加入5mg/ml MTT20μl/孔，置于37℃，5%CO2孵箱孵育4h，吸弃培养基，每孔加入150μl DMSO，摇床缓慢振摇10min，使结晶物充分溶解。酶标仪测定吸光度(OD)值。　　5、Hoechst33342染色按实验要求处理心肌细胞后，取出细胞爬片，4%的4℃多聚甲醛室温固定20 min，10 mg/ml Hoechst33342染液染色（染色条件：37℃，10min），PBS洗三遍，荧光微镜观察结果。　　6、心肌细胞凋亡检测（TUNEL染色法）细胞按照实验设计被处理后，用4.0%多聚甲醛固定20 min，20μg/ml蛋白酶K消化15 min；0.3%H2O2室温处理20 min；标记缓冲液(含0.03U/μl TdT和0.04 nmol/μl生物素-11-dUTP)湿盒中37℃孵育60 min；PBS冲洗3次，DAPI复染核。激光共聚焦显微镜观察细胞的情况。　　7、心肌细胞 cleaved caspase-3免疫荧光染色心肌细胞按实验设计处理结束后，取出细胞爬片，PBS洗三遍，4%的4℃多聚甲醛室温固定20 min，0.5% Triton X-100通透15 min，山羊血清封闭30 min，PBS洗三遍。cleaved caspase-3抗体（1：:100）4℃湿盒内孵育过夜，PBS洗三遍，二抗（FITC）室温2 h(避光)， PI染核，甘油封片，激光共聚焦显微镜观察结果。　　8、Western blot检测实验处理后心肌细胞内cleaved caspase-3和Nrf2表达水平以及Akt和ASK1-MKK3/MKK6-p38信号通路中的分子磷酸化水平心肌细胞按实验设计处理结束后，提取心肌细胞内蛋白，BCA法测定蛋白浓度，蛋白上样，SDS-PAGE电泳，然后将蛋白电转移至PVDF膜上，5%的脱脂奶粉封闭2h, TBST洗3次，每次10min；相应一抗4℃孵育过夜，洗膜3次，每次10min；加入二抗封袋，摇置2h；洗膜3次，每次10min；洗涤后用增强型化学发光液(ECL)显色后，利用 Quantity One软件采集图像并进行灰度值分析。　　9、心肌细胞内氧自由基检测心肌细胞按实验设计处理后，各组细胞被30μM DCF-DA孵育30 min（培养条件：37℃，5%CO2），PBS洗三遍，激光共聚焦显微镜观察载玻片上细胞的DCF荧光强弱，6孔板内细胞被胰酶消化后，流式细胞仪测量细胞平均DCF荧光密度。　　10、心肌细胞总抗氧化力（T-AOC）、超氧化物歧化酶（SOD）活性和丙二醛（MDA）含量测定心肌细胞被接种于6孔板中，培养3天后，按实验设计处理各组细胞。处理结束后，收集细胞，用4℃PBS洗三遍，用RIPA细胞裂解液裂解，4℃离心，取上清待测。参照试剂盒说明书测定心肌细胞T-AOC、SOD活性及MDA含量。　　结果：　　1、原代培养的SD雄性乳鼠心肌细胞稳定表达GPER1，使用G1（GPER1激动剂）活化GPER1抑制H2O2导致的心肌细胞活力下降，并且G1对心肌细胞的保护作用有明显的剂量依赖性和时间依赖性。G15（GPER1拮抗剂）可以阻断G1对H2O2处理心肌细胞的保护作用。H2O2诱导心肌细胞caspase-3活化和细胞凋亡，使用G1激活GPER1显著抑制H2O2处理后心肌细胞caspase-3活化和细胞凋亡，G15可以阻断G1的上述效应。　　2、H2O2诱导心肌细胞p38磷酸化，并且随着H2O2处理心肌细胞时间的延长，心肌细胞内p38的磷酸化水平越高。SB203580（一种选择性的p38抑制剂）抑制H2O2导致心肌细胞活力下降和caspase-3活化。上述结果表明，p38的激活参与了H2O2导致的心肌细胞损伤。进一步，使用G1活化GPER1显著抑制H2O2诱导的心肌细胞p38磷酸化，减少细胞内cleaved caspase-3水平，提高细胞活力。而GPER1的抑制剂G15可以阻断G1的上述效应。这些结果表明GPER1通过抑制p38的激活保护H2O2导致的心肌细胞损伤。　　3、H2O2处理后，心肌细胞中Akt的磷酸化水平和ASK1在丝氨酸83位点的磷酸化水平均显著下降。活化GPER1显著增加H2O2处理后心肌细胞中Akt和ASK1在丝氨酸83位点磷酸化水平，但G15和LY294002能抑制G1的这种效应。这些结果表明，在处于氧化应激损伤的心肌细胞中，GPER1可以活化Akt，活化的Akt使ASK1的丝氨酸83位点磷酸化，使ASK1失活。H2O2诱导心肌细胞MKK3和MKK6磷酸化，随着H2O2处理心肌细胞时间的延长，心肌细胞内MKK3和MKK6的磷酸化水平越高。使用G1活化GPER1能显著增加ASK1在丝氨酸83位点磷酸化水平，抑制MKK3，MKK6和p38的磷酸化水平。这些结果表明，GPER1通过抑制ASK1活性，从而抑制MKK3，MKK6和p38的活化，即GPER1抑制H2O2诱导ASK1-MKK3/6-p38信号通路活化。　　4、H2O2处理后，大鼠心肌细胞内DCF荧光强度明显升高，G1能显著抑制H2O2处理后心肌细胞内DCF荧光强度的升高，但G1的这种效应能被G15拮抗。H2O2导致大鼠心肌细胞内T-AOC和SOD活性明显下降，MDA含量明显升高，而G1能显著提高氧化应激状态下心肌细胞内T-AOC和SOD活性，减少MDA含量，但上述这些效应能被G15拮抗。这些实验结果证实活化的GPER1通过提高心肌细胞内源性抗氧化能力，抑制氧自由基产生，减轻脂质过氧化损伤。　　5、G1可以显著增加氧化应激状态下心肌细胞中Akt的磷酸化和核内Nrf2蛋白的水平。G15可以阻断G1对Akt的磷酸化和核内Nrf2表达的增加。更重要的是LY-294002（IP3K抑制剂）也能阻断G1对Akt的磷酸化和核内Nrf2表达的增加。这些实验结果表明在心肌细胞氧化应激状态下，活化的GPER1可以激活PI3K/Akt信号通路，进而促进细胞核内Nrf2表达的增加。　　结论：　　1、活化GPER1能够保护心肌细胞抵抗H2O2导致的细胞活力下降，但其心肌保护能力与它被活化的程度以及活化的时间点有关。GPER1抑制H2O2导致的心肌细胞caspase-3活化和细胞凋亡是GPER1心肌保护作用的一个重要的机制。　　2、活化GPER1使心肌细胞中Akt活性增加，促进ASK1丝氨酸83位点磷酸化，使ASK1活性下降，进而抑制H2O2活化的ASK1-MKK3/6-p38信号通路，最终减少H2O2导致的心肌细胞凋亡。　　3、H2O2导致心肌细胞内氧自由基增多，细胞抗氧化能力下降，细胞脂质过氧化，进而使整个心肌细胞处于氧化应激状态，最终导致细胞凋亡。而活化GPER1经PI3K/Akt信号通路，上调节Nrf2的表达，恢复细胞抗氧化能力，抑制心肌细胞的氧化应激。