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目的脊髓进行性压迫是脊柱外科领域最常见的一种致病因素;其病理机制既包含逐渐加重的机械性损伤,又存在着脊髓缺血性损伤。颈椎病脊髓型、髓外肿瘤、后纵韧带骨化以及脊柱结核等疾病,均可引起脊髓压迫性损伤,但迄今为止对其机制的研究尚缺乏一个理想的实验动物模型。因此,建立一个科学的大鼠脊髓压迫性损伤实验动物模型,可为脊髓受压后的基本病理生理过程及其分子机制的研究奠定基础。方法①解剖大鼠椎骨椎管,观察大鼠椎骨及脊柱的形态特点,脊髓与椎骨的对应关系。根据大鼠椎骨及脊柱结构特点,为脊髓压迫器的设计寻找适宜的支撑点;②根据大鼠脊柱结构特点自行设计大鼠脊髓压迫器。用自行设计的压迫器制作大鼠进行性压迫实验动物模型;③观察大鼠行为学的变化;④运用影像学、HE和Nissel氏染色、TTC等方法,评价该模型的可靠性。结果①大鼠脊髓腰膨大位于第一腰椎椎体后方,大鼠脊髓圆锥平面较低,约平第三腰椎。②胸腰椎的椎板上各有一对呈楔状的前关节突和两对后关节突,即一对后上关节突和一对后下关节突,后位椎骨的前关节突与前位椎骨的上、下后关节突相镶合,形成稳定的关节。③从第10胸椎开始至第5腰椎为止,其棘突由后下伸向前上。根据以上三个解剖结构特点自制脊髓压迫器制作模型。压迫器包括三个部分:模拟L1椎板固定部分、压迫钢板、螺丝钉。④随着脊髓压迫程度和压迫时间的增加,逐渐出现大鼠肌力减退、行动缓慢,后肢瘫痪,大小便失禁。⑤TTC、HE和Nissel染色结果显示,在各时间段均可见脊髓缺血,其范围与压迫时间及压迫强度相关;脊髓缺血严重的区域组织出现水肿、神经元空泡化、白质疏网状改变及退行性变;而脊髓缺血较轻的区域神经元和胶质细胞的形态学改变主要为尼氏体减少甚至消失等改变。结论①大鼠胸腰段的结构特点为脊髓压迫器的固定提供了理想的力学支撑点,为自行设计脊髓压迫器提供了形态学基础。②自行设计的脊髓压迫器具有结构合理、固定牢固、易于安装等优点。③用自制大鼠脊髓压迫器制作而成的大鼠脊髓进行性压迫模型,可复制脊髓压迫性损伤的病理过程,具有方法简单、科学、重复性强等特点。④脊髓压迫程度可根据实验目的不同进行调节。⑤自行设计的脊髓压迫器是研究脊髓慢性压迫性损伤机制的理想实验动物模型。⑥术后行为学、影像学、TTC及组织学观察发现,脊髓进行性压迫损伤的行为学和病理学改变与临床脊髓进行性压迫损伤基本相同。第二部分大鼠脊髓进行性压迫性损伤Caspase-12表达与细胞凋亡目的:观察大鼠脊髓进行性压迫性损伤组织中细胞凋亡、Caspase-12的表达变化规律以及细胞超微结构的变化,探讨脊髓进行性压迫性损伤细胞凋亡的分子机制。方法:①随机选用健康成年wistar大鼠120只,雌雄不拘,体质量250-300g。随机将动物分为两组:脊髓进行性压迫组共计60只,每个时间点10只;假手术组60只,每个时间点10只。②按照自行设计的方法,制作动物脊髓压迫模型;假手术组只作全椎板切除,不作脊髓压迫。③于术后第1、3、7、14、21、28d取出脊髓,运用Tunel染色、免疫组化、Western bloting、电镜技术等方法观察脊髓进行性压迫性损伤后,脊髓的病理变化和内质网的形态学改变、细胞凋亡及Caspase-12的表达变化的规律,以探讨其相互间的关系。④计算机图像分析系统和SPSS 10.0统计分析软件对所得的图像和数据进行分析。结果:①电镜结果显示,细胞形态改变主要为:胞质皱缩、核膜皱折、异染色质边聚、核浓缩等改变;也可见不同程度的细胞肿胀,线粒体肿胀、内质网肿胀及内质网模溶解等变化。在各压迫时间段均可见神细胞内质网结构不同程度的改变。②Tunel染色显示脊髓受压早期,即可见细胞凋亡,随着压迫时间的延长,神经元和神经胶质细胞凋亡数量明显增加。细胞凋亡的发生率在1、3、7、14、21、28d分别为:(12.5±2.3)%、(13.0±3.6)%、(17.2±4.3)%、( 17.2±4.3)%、( 36.1±6.5)%、(2.3±7.9)%。手术组与假手术组间比较有显著性差异(P<0.05);③而与此相对应,Caspase-12的阳性细胞于术后1、3、7、14、21、28d表达分别为(18.47±2.16)、( 22.03±2.53)、(25.12±3.12)、(30.70±4.26)、(31.37±4.82)、(26.62±3.84)个,手术组与假手术组间比较有显著性差异(P<0.05));显示凋亡的发生率与Caspase-12的表达增强而增加。④western blotting结果提示Caspase-12的蛋白表达随脊髓压迫时间延长和程度的加重而增强,手术组与假手术组间比较有显著性差异(P<0.05)。⑤表明Caspase-12表达与细胞凋亡的时空变化规律相一致。结论:在脊髓进行性压迫过程中,神经细胞凋亡是引起脊髓损伤的主要病理因素,细胞凋亡诱导了脊髓继发性退行性变,Caspase-12可能参与了脊髓进行性压迫性损伤所导致的细胞凋亡。第三部分脊髓进行性压迫致内质网途径细胞凋亡信号转导的机制研究目的观察脊髓进行性压迫性损伤神经细胞内Ca2+浓度、Ire1、Grp78及Caspase-12的表达变化规律;以探讨脊髓压迫缺血性损伤内质网应激所致细胞凋亡信号转导途径的意义,以期为临床干预性治疗提供实验基础。方法成年Wistar大鼠,随机分为手术组和假手术组,按照本文作者自行设计的方法制作大鼠脊髓压迫模型;假手术组,只作全椎板切除,不做脊髓压迫,分别于术后1、3、7、14、21、28d取出脊髓。运用生物化学、免疫组化、Western bloting、RT-PCR和图像分析等方法观察脊髓进行性压迫缺血性损伤后,脊髓神经细胞内Ca2+的浓度、Ire1、Grp78及Caspase-12的表达变化规律。结果行脊髓进行性压迫后,神经细胞内Ca2+浓度于术后1、3、7、14、21、28d均呈现升高趋势;各时间段神经细胞内Ca2+的浓度分别为:371.78±69.35;383.26±10.47;402.6±62.23;417.15±67.56;313.34±12.39;297. 45±28.71 nmol/L。手术组与假手术组比较有显著性差异(P<0.05)。Grp78 mRNA和Grp78检测结果显示,在脊髓进行性压迫各组Grp78 mRNA和Grp78均呈现出相同的表达增高趋势,于7d到达峰值,于术后14、21、28 d Grp78 mRNA的表达仍处于较高水平,而Grp78蛋白的表达水平却逐渐下降;手术组与假手术组比较有显著性意义(P<0.05)。Ire1 mRNA和Ire1检测发现,术后1d即有较高水平表达。术后3、7、14d Ire1 mRNA和Ire1的表达呈迅速增高,术后21、28d Ire1 mRNA和Ire1的表达均逐渐下降,手术组与假手术组比较有显著性差异(P<0.05)。Caspase-12 mRNA和Caspase-12的表达于术后1、3、7、14 d逐渐升高,并分别于14、21d达到峰值。术后28 d Caspase-12 mRNA和Caspase-12的表达均下降。手术组与假手术组比较有显著性意义(P<0.05)。结论⑴脊髓进行性压迫缺血性损伤导致细胞内Ca2+浓度升高而引起内质网应激;⑵Ire1的表达标志着内质网上未折叠蛋白积聚以及相关蛋白的表达增加;⑶Grp78的高水平表达反映内质网应激的程度以及Grp78对细胞的保护作用;⑷Caspase-12的表达预示内质网过度应激反应诱导细胞凋亡的产生;⑸Ire1、Grp78和Caspase-12双标结果显示,在不同时间段强弱不同的同时表达,表明这三个蛋白都参与了内质网应激所致细胞凋亡信号转导的调节。