【摘 要】
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皱纹盘鲍(Haliotis discus hannai)是山东半岛的主要养殖鲍鱼品种,占其软组织30%~40%左右的脏器在加工过程中通常作为下脚料被废弃,但是鲍鱼脏器中存在多种具有活性的生物酶,为了更加有效地综合利用鲍鱼脏器,减少环境污染,本文从皱纹盘鲍的消化道及消化腺内分离得到了具有高活力的鲍鱼消化酶,并对酶的提取条件进行相应的优化,对得到的鲍鱼消化酶进行分离纯化,并对其酶促反应动力学进行研究,
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皱纹盘鲍(Haliotis discus hannai)是山东半岛的主要养殖鲍鱼品种,占其软组织30%~40%左右的脏器在加工过程中通常作为下脚料被废弃,但是鲍鱼脏器中存在多种具有活性的生物酶,为了更加有效地综合利用鲍鱼脏器,减少环境污染,本文从皱纹盘鲍的消化道及消化腺内分离得到了具有高活力的鲍鱼消化酶,并对酶的提取条件进行相应的优化,对得到的鲍鱼消化酶进行分离纯化,并对其酶促反应动力学进行研究,最后将鲍鱼消化酶(纤维素酶和淀粉酶)与市面上购买的商品酶(同种酶)对龙须菜降解效果进行对比,得到的结论如下:1)对鲍鱼消化酶进行提取,得到三种高活力的酶分别是淀粉酶、纤维素酶、褐藻胶裂解酶。纤维素酶最佳提取条件为硫酸铵添加饱和度50%~60%,PBS缓冲液最佳浓度为0.10 mol/L,p H为5.5,提取量为73.8 mg;淀粉酶最佳提取条件为硫酸铵添加饱和度40%~50%,PBS缓冲液最佳浓度为0.10 mol/L,p H为6.0,提取量为115.5mg;褐藻胶裂解酶硫酸铵分段盐析,硫酸铵添加饱和度80%~90%,PBS缓冲液最佳浓度为0.05 mol/L,p H为8.2,提取量为14.79 mg。2)采用超滤与CM-52阳离子交换层析相结合的方式对鲍鱼消化酶中的淀粉酶及纤维素酶进行分离纯化,其中纤维素酶最高比活力为229.83 U/mg;纤维素酶经多个步骤纯化最终比活力提高了6.45倍,得率为17.08%;淀粉酶CM-52阳离子交换层析时,淀粉酶活峰值比活力为509.96 U/mg;皱纹盘鲍皱纹盘鲍淀粉酶经多个步骤纯化最终比活力提高了4.95倍,得率为19.01%。3)纤维素酶酶促动力学结果显示:纤维素酶添加0.44 mg情况下,底物浓度逐渐增加至8 mg/m L时底物过量,酶促反应最适p H为6.0,降解羧甲基纤维素的最适温度为45℃,测定维素酶的酶反应速度时,酶反应时间以30 min以内为宜;纤维素酶Km值为1.7643 mg/m L,Vmax为1.8975 mg·L-1·min-1。4)淀粉酶酶促动力学结果显示:淀粉酶添加0.22 mg情况下,底物浓度增加至3 mg/m L时底物过量,底物最适p H为6.0,酶解淀粉溶液最适温度为40℃,测定淀粉酶的酶反应速度时,酶反应时间以40 min以内为宜;淀粉酶Km值为1.4734 mg/m L,Vmax为3.8329 mg·L-1·min-1。5)对皱纹盘鲍消化酶酶解龙须菜的工艺进行了研究,并将其与同种商品酶(淀粉酶、纤维素酶)进行比较,商品酶正交试验发现,温度对龙须菜酶解反应影响最强,然后依次是纤维素酶添加量>时间>淀粉酶添加量>p H,而料液比影响程度最低;最终得到最佳酶解条件为纤维素酶添加量1.2%,淀粉酶添加量1.2%,时间2.5 h,温度50℃,p H为7.0,料液比1:25(g:m L);鲍鱼消化酶正交试验优化发现,淀粉酶添加量对龙须菜酶解反应影响最强,主效应最明显,然后依次是纤维素酶添加量>温度>料液比>p H,而时间影响程度最低;最佳条件为纤维素酶添加量1.6%,淀粉酶添加量0.6%,时间2.5 h,温度40℃,p H为6.0,料液比1:15(g:m L)。6)商品酶正交后最佳酶解条件下龙须菜多糖平均聚合度为4.0032,而鲍鱼消化酶最佳酶解条件下龙须菜多糖平均聚合度为1.9892,显而易见鲍鱼消化酶酶解龙须菜效果比商品酶要好。
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