牙周炎是一种慢性炎症性疾病,以牙周支持组织进行性破坏为特征,最终可导致牙齿脱落丧失,从而危害口腔和全身健康,影响患者生活质量。然而,目前牙周病的治疗方案尚不能有效恢复牙周组织的再生能力,因此未能从根本上解决牙周组织缺损这一重要临床问题。近年来,应用干细胞进行组织和器官修复与再生的研究越来越多。牙周组织中也存在一类间充质干细胞——牙周膜干细胞(Periodontal ligament stem cells,PDLSCs),这类细胞可能成为牙周再生的关键细胞。以往的研究发现,牙周炎来源的PDLCSs表现为再生能力下降,因此明确炎症PDLSCs再生能力下降的调控机制是解决牙周炎组织缺损修复再生的关键。线粒体融合蛋白主要存在于线粒体外膜上,包括线粒体融合蛋白-1(Mitofusin1,Mfn1)和线粒体融合蛋白-2(Mitofusin2,Mfn2),在介导线粒体动态的过程中具有重要作用。值得注意的是,小部分的Mfn2也存在于内质网膜上,并且能够使内质网与线粒体在结构和功能上密切相连。课题组以往研究表明,炎症微环境中,PDLSCs中内质网应激水平升高,并能够进一步导致其成骨分化能力下降。同时线粒体对于细胞的能量代谢以及干细胞的增殖分化,也具有至关重要的作用。因此,线粒体融合蛋白作为能够同时调控内质网和线粒体的重要蛋白分子,可能参与调控牙周膜干细胞的分化再生过程。此外,课题组以往研究表明炎症因子能够激活wnt/β-catenin通路进而抑制PDLSCs的成骨分化能力,但是其具体调控机制和作用靶点尚不明确。本研究分离培养正常及炎症来源的PDLSCs,同时应用炎症因子模拟炎症微环境,首先明确了炎症微环境能够导致PDLSCs成骨分化能力下降;然后,进一步检测炎症微环境下,线粒体融合蛋白表达的改变,透射电镜及共聚焦显微镜下观察内质网线粒体偶联结果及线粒体长度变化;在此基础上进一步探讨线粒体融合蛋白对于PDLSCs成骨分化能力的影响;最后探究Wnt/β-catenin信号通路通过线粒体融合蛋白调控PDLSCs成骨分化的作用机制。本课题不但能够为牙周炎的干细胞治疗提供新的靶点,而且丰富了炎症微环境与干细胞在细胞器层面的相关研究,具有重要的科研和临床意义。第一部分炎症微环境对PDLSCs成骨分化能力的影响目的分离并体外培养健康组织来源的H-PDLSCs和炎症组织来源的P-PDLSCs,并进行间充质干细胞鉴定,对比两种来源PDLSCs的成骨分化能力。在模拟炎症微环境下,进一步检测PDLSCs成骨分化能力改变。方法(1)分别由正常及慢性炎症牙周组织中提取牙周膜,并通过有限稀释法培养PDLSCs。(2)流式细胞仪检测PDLSCs的干细胞标志物。(3)选取第2代H-PDLSCs,在培养基中加入10ng/ml的TNF-a模拟炎症微环境培养7天后,培养并传代至第3、4代,传代后应用正常培养基培养。(4)成骨培养基诱导正常、炎症及TNF-a刺激后的PDLSCs成骨向分化。qRT-PCR检测成骨相关基因表达。茜素红染色检测各组PDLSCs中矿化结节形成能力。结果(1)本实验获取两种来源的PDLSCs经流式细胞仪检测,其间充质干细胞表面分子特异性标记物CD105、CD90呈强阳性,造血系统来源的表面标记物CD34、CD45均为阴性表达。(2)成骨分化诱导H-PDLSCs和P-PDLSCs并进行成骨分化能力检测,结果表明,两种来源的PDLSCs均具有成骨向分化能力。但炎症组的成骨基因表达及矿化结节形成能力均显著低于正常组。(3)经TNF-a刺激后,其成骨基因表达低于H-PDLSCs组,且矿化结节形成能力下降。结论(1)本实验提取的PDLSCs为间充质干细胞,具有成骨向分化能力。(2)炎症微环境作用下,PDLSCs的成骨分化能力下降。这种成骨分化能力下降的特征,即使在脱离炎症微环境并多次传代后,仍然可以在子代细胞中保留。第二部分炎症微环境下线粒体融合蛋白表达及其介导的细胞器活动改变目的探究炎症微环境下PDLSCs中线粒体融合蛋白Mfn1、Mfn2表达量的改变,并进一步检测内质网—线粒体偶联结构及线粒体长度的改变。方法(1)qRT-PCR检测H-PDLSCs、P-PDLSCs与H-PDLSCs+TNF-α组中Mfn1、Mfn2表达量。(2)透射电镜下观察并对比H-PDLSCs、P-PDLSCs与H-PDLSCs+TNF-α组中的线粒体长度以及内质网—线粒体偶联结构,应用Image Pro Plus进行测量,定量统计及分析。(3)应用特异性细胞器探针分别进行内质网、线粒体染色,共聚焦显微镜下观察并对比H-PDLSCs与P-PDLSCs、H-PDLSCs与H-PDLSCs+TNF-α的内质网与线粒体共定位情况,应用Image Pro Plus进行测量,定量统计及分析。结果(1)与H-PDLSCs组相比,P-PDSLCs组及H-PDLSCs+TNF-α组中Mfn1、Mfn2表达量显著升高。(2)透射电镜下观察结果:P-PDSLCs组及H-PDLSCs+TNF-α中的线粒体长度,以及内质网线粒体偶联长度分别与内质网和线粒体周长之比均显著高于H-PDSLCs组。(3)共聚焦显微镜下观察结果:与H-PDLSCs相比,P-PDSLCs组及H-PDLSCs+TNF-α组中内质网及线粒体重叠增加,统计结果表明两种细胞器荧光染色的共定位系数显著升高。结论(1)炎症微环境作用下,线粒体融合蛋白Mfn1、Mfn2表达量增加。(2)炎症微环境作用下,内质网—线粒体偶联及线粒体融合活动增加。第三部分线粒体融合蛋白对PDLSCs成骨分化能力的调控作用目的探究炎症微环境下,线粒体融合蛋白Mfn1、Mfn2对PDLSCs成骨分化能力的影响。方法(1)应用siMfn1、siMfn2分别下调P-PDLSCs中Mfn1、Mfn2的表达,成骨诱导液培养7d时qRT-PCR检测成骨基因表达,28d茜素红染色及氯化十六烷基吡啶定量检测其矿化结节形成差异。(2)应用质粒过表达H-PDLSCs中的Mfn1、Mfn2,成骨诱导液培养7d时qRT-PCR检测成骨基因表达,28d茜素红染色及氯化十六烷基吡啶定量检测其矿化结节形成差异。结果(1)分别下调P-PDLSCs中Mfn1、Mfn2表达量后,成骨基因表达量增加,矿化结节形成能力增强。(2)分别上调H-PDLSCs中Mfn1、Mfn2表达量后,成骨基因表达下降,矿化结节形成减少。结论线粒体融合蛋白Mfn1、Mfn2的表达增加对PDLSCs的成骨分化能力具有抑制作用。实验四Wnt/β-catenin通路通过线粒体融合蛋白调控PDLSCs成骨分化目的探究Wnt/β-catenin信号通路激活对线粒体融合蛋白表达的影响,以及内质网—线粒体偶联结构及线粒体融合活动的改变,并进一步讨论线粒体融合蛋白在Wnt/β-catenin通路调控PDLSCs成骨分化过程中的作用。方法(1)应用LiCl激活H-PDLSCs中Wnt/β-catenin信号通路。成骨诱导后,qRT-PCR检测成骨因子表达量,茜素红染色检测矿化结节形成。(2)qRT-PCR检测LiCl刺激后PDLSCs中Mfn1、Mfn2基因表达量改变。(3)透射电镜及共聚焦显微镜下观察内质网—线粒体偶联结构,并进行定量分析。(4)透射电镜下观察线粒体融合程度,并进行定量分析。(5)Wnt/β-catenin通路激活后应用siMfn1、siMfn2分别下调PDLSCs中Mfn1、Mfn2表达量,同时成骨诱导,并进行成骨分化能力检测。结果(1)与H-PDLSCs组相比,LiCl刺激后成骨基因表达量下降,矿化结节形成减少。(2)LiCl刺激后PDLSCs中Mfn1、Mfn2表达量升高,透射电镜及共聚焦显微镜下观察并测量统计,结果显示内质网和线粒体共定位水平增加,线粒体平均长度增加。(3)下调H-PDLSCs+LiCl组中的Mfn1、Mfn2表达量后,其成骨分化能力增强。结论(1)激活H-PDLSCs中的Wnt/β-catenin通路后,其成骨分化能力下降。(2)Wnt通路激活后,PDLSCs中的线粒体融合蛋白表达升高,内质网—线粒体偶联程度增加,线粒体融合增加。(3)下调Mfn1、Mfn2表达量,可逆转由Wnt通路激活引起的成骨分化能力下降。