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目的：预先短暂的亚致死性缺血或其它亚致死性应激可对随后的损伤性缺血提供保护作用，此现象被称为缺血预处理(ischemic preconditioning，IPC)。最先在心脏发现缺血预处理的保护作用，随后许多研究证实在其他器官组织也存在缺血预处理现象。进一步研究发现，一个器官的短暂缺血可诱导另一器官的缺血耐受，此现象被称为远隔预处理(remote ischemic preconditioning)。我室近期研究表明，反复3次股动脉夹闭和开放的肢体缺血预处理(limb ischemic preconditioning，LIP)可减轻随后即刻发生的大鼠脑缺血再灌注损伤，证实了远隔器官缺血预处理对脑的保护作用。但是，这种远隔预处理对脑的保护作用与传统的脑缺血预处理的脑保护作用是否存在相似的机制尚不清楚。
热休克蛋白(heat shock protein，HSP)亦称应激蛋白，是在生理或病理应激状态下于细胞内诱导合成的蛋白质，对应激细胞起保护作用。分子量为70kd的HSP家族是HSPs中最被关注、研究最深入的一种。研究表明，HSP70参与脊髓、心肌、骨骼肌等许多器官组织的缺血预处理保护作用。在海马脑片、沙鼠和大鼠脑缺血耐受模型中，脑缺血预处理均可诱导海马CA1区锥体神经元HSP70的表达增加，并增强了神经元对脑缺血的耐受性；应用HSP70诱导剂或HSP70抑制剂可增强或抑制脑缺血耐受的诱导。这些结果提示，HSP70在脑缺血预处理诱导的脑缺血耐受中发挥重要作用。我室赵红岗等应用免疫组化方法观察到LIP也可诱导海马CA1区HSP70的表达上调，初步提示HSP70可能在LIP诱导的脑缺血耐受中发挥作用。为进一步探讨HSP70在LIP诱导的脑缺血耐受中的作用，本研究应用western blot分析和免疫组化法，进一步观察LIP对大鼠海马HSP70的表达的影响，在此基础上，观察HSP70抑制剂槲皮素(Quercetin)对LIP诱导的大鼠脑缺血耐受的影响，以证实HSP70在LIP诱导的脑缺血耐受中的作用。
方法：
1.LIP对大鼠海马HSP70表达的影响大鼠60只，随机分为sham组和LIP组。Sham组动物行LIP的sham手术(暴露但不夹闭股动脉)，于sham手术后6h取材。LIP组动物行LIP(夹闭双侧股动脉10 min后再恢复灌流10 min，重复三次)。根据LIP后不同取材时间点分为LIP 6h、12h、ld、2d、3d、4d和5d七个亚组。应用western blot分析和免疫组化法观察大鼠海马HSP70的表达。
2.HSP70抑制剂Quercefin对LIP脑保护作用的影响36只椎动脉永久凝闭的大鼠随机分为以下6组：(1)sham组：行全脑缺血的sham手术(暴露双侧颈总动脉，但不阻断血流)；(2)LIP组：行LIP(见上述)；(3)脑缺血组：LIP的sham手术后立即行全脑缺血8 min；(4)LIP+脑缺血组：LIP后即刻行全脑缺血8 min；(5)Quercetin+LIP+脑缺血组：LIP前30 min、LIP后即刻、以及LIP后1d、2d、3d、4d、5d、6d、7d分别给与HSP70抑制剂Quercetin(50mg/kg，腹腔注射)，其余同LIP+脑缺血组：(6)DMSO+LIP+脑缺血组：腹腔注射3％的DMSO溶液4 mL/kg，注射时间及其它处理同Quercetin+LIP+脑缺血组。所有动物均于末次手术后7天断头取材，硫堇染色确定海马CA1区组织学分级(histological grade，HG)和神经元密度(neuronal density，ND)，以反映迟发性神经元死亡(delayed neuronal death，DND)情况。结果：
1.LIP上调大鼠海马HSP70的表达Western blotting分析表明，LIP后海马CA1区HSP70表达水平随LIP后再灌注时间的延长呈动态变化。与sham组相比较，HSP70的表达于LIP后1d开始升高(p＜0.05)，2d达到高峰，3d开始回落，5d接近sham水平。HSP70在海马CA3/DG区的表达于LIP后也有增强，但表达时程与海马CA1区有所不同。与sham组相比较，海马CA3/DG区HSP70表达于LIP后2d明显增强(P＜0.05)，3d达到高峰，4d开始降低，5d回落至接近sham水平。免疫组化染色显示相类似的结果。sham组海马各区少见HSP70阳性细胞。与sham组相比较，LIP后1d海马CA1区HSP70阳性染色开始增加(P＜0.05)，2d达到高峰；而海马CA3/DG区则于LIP后2dHSP70阳性染色开始增加(P＜0.05)，3d达高峰。
以上结果表明，LIP可上调大鼠海马HSP70的表达，提示HSP70可能是LIP诱导的脑缺血耐受的机制之一。
2.HSP70抑制剂Quercetin抑制LIP的脑保护作用硫堇染色结果显示，sham组和LIP组大鼠海马CA1区无明显的DND，HG为0～I级，ND分别为220±15.1、216±12.5。脑缺血组大鼠海马CA1区出现明显的组织损伤，与sham组和LIP组比较，HG(Ⅱ～Ⅲ级)明显升高，ND(47±17.1)显著降低(P<0.01)。这些变化提示，8 min脑缺血打击引起海马CA1区出现严重的DND。LIP+脑缺血组中，海马CA1区未见明显细胞损伤，其HG(0～I级)和ND(193±19.4)与sham组相近；而与脑缺血组相比，其HG明显降低，ND明显升高(P<0.01)，表明LIP可诱导产生脑缺血耐受，减轻脑缺血再灌注引起的海马CA1区锥体神经元DND。给予3％的DMSO对LIP诱导的脑缺血耐受无明显影响，其HG(0～I级)和ND(188±22.6)与LIP+脑缺血组相近。然而，给予Quercetin则明显阻断了LIP的脑保护作用，在海马CA1区出现了明显的DND，与LIP+脑缺血组相比，HG(Ⅱ～Ⅲ级)显著升高，ND(58±14.1)显著降低(P<0.01)。上述结果表明，LIP可以诱导大鼠脑缺血耐受，而给与HSP70抑制剂Quercetin可以阻断这种保护作用。
结论：
1.LIP后海马HSP70的表达明显增高；
2.LIP可以诱导大鼠海马CA1区脑缺血耐受，给与HSP70抑制剂Quercetin可以阻断这种保护作用。
3.结果表明，HSP70参与LIP诱导的大鼠脑缺血耐受。