论文部分内容阅读
法布莱氏病是一种X连锁隐性遗传病，由定位于Xq22的α-半乳糖苷酶A（alpha-galactosidaseA，α-GalA）基因突变使酶失活造成。研究表明，人体内α—半乳糖苷酶的先天性缺乏而致使其底物N-脂酰鞘氨醇己三糖苷在全身细胞、组织和器官中累积而引起血液循环障碍并进一步导致心、肾功能衰竭和神经系统紊乱而死亡。法布莱氏病在男性中发病率为1／40000，而且在早期一般很难诊断。若不能及时诊断治疗，患者一般在40岁左右就会死于心、肾功能衰竭和神经系统紊乱，女性发病时间稍晚，一般在40-50岁发病。法布莱氏病的早期诊断治疗对阻止病情发展，改善病人生存质量，延长病人生存时间具有重要意义。利用α-半乳糖苷酶A单抗检测患者体内的α-半乳糖苷酶A蛋白水平是法布莱氏病早期诊断的可靠方法。为了获得效价高的、特异性强的抗人α-半乳糖苷酶A单克隆抗体，本文使用计算机软件分析α-半乳糖苷酶A的优势抗原表位，合成2个具有强抗原性的多肽并与载体蛋白KLH偶联，免疫小鼠，采用甲基纤维素半固体培养基筛选杂交瘤细胞株。使用酶联免疫、SDS-PAGE、Western-Blot和染色体核型分析等方法对杂交瘤细胞及其产生的单抗进行鉴定。筛选到1株稳定表达α-半乳糖苷酶A单抗杂交瘤细胞株。制备的单抗属IgG1亚型，能够特异性地与人α-半乳糖苷酶A反应，并展示出很强的亲和力。采用酶联免疫方法用获得的单克隆抗体检测12例正常人及5例法布莱氏病患者血浆中的α-半乳糖苷酶A。结果患者组的OD450吸光度平均值为0.159±0.063（最大0.238，最小0.080），低于正常组的平均吸光度值0.481±0.116（最大0.694，最小0.332）。同时酶活性检测血浆中α-半乳糖苷酶活性，患者组的吸光度平均值为0.015±0.008（最大0.024，最小0.004），低于正常组的吸光度平均值0.032±0.006（最大0.044，最小0.022）。但是在抗体检测的结果中一例患者的OD450吸光度值接近正常人的，这是因为有的病人α-半乳糖苷酶A蛋白有较高的表达水平，却无水解活性。将单抗检测与酶活性检测相结合，可以增加了断的可靠性，为进一步研究法布莱氏病的诊断奠定了基础。向病人体内注射α-半乳糖苷酶A的酶替代疗法是目前治疗法布莱氏病最有效的方法，但如何获得足量、高纯度的α-半乳糖苷酶A是使用酶替代疗法的前提。本文的另一个目的是克隆人α-半乳糖苷酶A（α-GalA）cDNA，并在毕赤酵母中表达重组的人α-GalA。利用RT-PCR方法从人肝癌细胞中克隆人α-半乳糖苷酶A cDNA，测序结果说明获得的序列与文献报道一致。将α-半乳糖苷酶A cDNA构建到可用甲醇诱导的分泌型毕赤酵母表达载体pPICZαA。重组载体导入毕赤酵母后使用Zeion抗生素筛选转化细胞。在甲醇诱导后，使用SDS-PAGE、Western印迹及酶活测定方法检测酵母上清中人α-GalA。我SDS-PAGE结果表明在酵母培养上清中有大约46KD的条带，与预期的α-GalA的大小一致，该条带能够特异的与抗α-GalA单抗结合。进一步研究表明培养上清中有α-GalA活性。研究结果初步证明，我们获得了具有生物活性重组的α-GalA蛋白。我们将进一步优化重组蛋白的诱导表达条件，为获得批量的α-GalA并用于临床治疗提供基础。