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目的:本实验以3月龄、12月龄、20月龄SPF级BALB/c小鼠为研究对象,采用高通量测序技术分析小鼠骨髓和脾脏B细胞、脾脏记忆B细胞BCR H-CDR3组库的特征,探讨不同月龄小鼠B细胞、记忆B细胞BCR H-CDR3组库的动态变化,为免疫系统衰老研究提供基础数据及新的研究思路。方法:1.分别取3、12、20月龄BALB/c小鼠骨髓和脾脏组织的B细胞、脾脏组织的记忆B细胞,样本的数量分别为:小鼠骨髓组织B细胞每个月龄5个样本、小鼠脾脏组织B细胞每个月龄5个样本、脾脏组织记忆B细胞每个月龄3个样本。2.制作组织切片分别观察3、12、20月龄小鼠脾脏组织结构的形态差异(每种月龄3只)。3.采用德国美天旎磁珠分选试剂盒分选出3、12、20月龄小鼠脾脏记忆B细胞,并用流式细胞仪鉴定分选纯度。4.采用QIAGEN基因提取试剂盒分别提取各样本中的DNA,并用分光光度计鉴定纯度。每个样本均采用多重PCR构建小鼠BCR H-CDR3组库,用琼脂糖凝胶电泳分离出所需要的目的条带(100-200bp)并割胶回收。采用高通量测序技术对BCR H-CDR3组库进行测序(测序由华大基因完成)。5.每个样本测序后获得的数据上传至IMGT(http://www,imgt.org)数据库,分析BCR H-CDR3组库序列的组成和特征。(1)采用反辛普森指数(The inverse Simpson’s diversity index,1/DS)分析CDR3组库的多样性,(2)分析BCR H-CDR3组库V、D、J基因家族的取用;(3)对AA的取用和长度分布进行分析;(4)对CDR3组库中独特AA重叠序列进行分析等。结果:1.3月龄小鼠的脾脏组织白髓多而密集,随着月龄的增加白髓结构变的不规则。2.BCR H-CDR3组库特征分析:2.1.不同月龄小鼠骨髓B细胞组库的测序及分析结果:(1)不同月龄小鼠骨髓B细胞BCR H-CDR3组库功能性的独特序列/总序列数目:M3BM1:470417/3628039;M12BM1:196523/1421157;M20BM1:242712/1487032M3BM2:518486/4184188;M12BM2:156116/1464383;M20BM2:200002/1310079M3BM3:381821/764189;M12BM3:64755/500687;M20BM3:120696/557000M3BM4:177963/1348026;M12BM4:183714/1101831;M20BM4:76015/426278M3BM5:178321/1293633;M12BM5:169852/1654244;M20BM5:67526/310777(2)不同月龄小鼠骨髓B细胞BCR H-CDR3组库均高频取用IGHV1-14、IGHV1-4、IGHV14-1、IGHV1-50、IGHV1-56、IGHV1-64家族,对高频取用家族进行统计分析发现,IGHV14-1基因家族具有统计学差异;在IGHV-IGHJ基因优势配对取用中,有IGHV14-1-IGHJ3、IGHV1-50-IGHJ4基因配对取用具有统计学差异;通过聚类分析结果显示,12月龄和20月龄的V-J基因配对取用最接近,而3月龄相差较远。(3)不同月龄小鼠骨髓B细胞BCR H-CDR3组库AA的长度均是以11-12个AA为主的高斯分布,均高频取用酪氨酸(Y)为代表的疏水性氨基酸,AA取用均无统计学差异。(4)不同月龄小鼠骨髓B细胞BCR H-CDR3组库多样性(1/DS)无统计学差异;不同月龄小鼠共同独特氨基酸数目为29742条;前10条高频克隆扩增氨基酸序列几乎都存在高度保守的氨基酸基序“WYFDV”和“YAMDY”。2.2.不同月龄小鼠脾脏B细胞的测序及分析结果:(1)不同月龄小鼠脾脏B细胞BCR H-CDR3组库功能性的独特序列/总序列数目:M3S1:778821/4490891;M12S1:101368/1038593;M20S1:134395/1290012M3S2:676115/3986587;M12S2:280350/1352262;M20S2:206742/1651382M3S3:631673/4388235;M12S3:225851/1373556;M20S3:125701/532054M3S4:601045/3909490;M12S4:265041/1536963;M20S4:172405/995363M3S5:565442/2667877;M12S5:207727/1489695;M20S5:156198/575928(2)不同月龄小鼠脾脏B细胞BCR H-CDR3组库都高频取用IGHV1-14、IGHV014-1、IGHV1-50、IGHV1-4、IGHV1-64,仅IGHV1-4基因取用具有统计学差异;在IGHD基因的取用中,IGHD3-3、IGHD6-3取用随月龄改变具有统计学差异;对于IGHJ2基因取用随月龄的改变具有统计学差异;在IGHV-IGHJ优势配对取用中IGHV1-50-IGHJ2基因配对取用具有统计学差异;通过聚类分析结果显示,12月龄和20月龄的IGHV-IGHJ基因配对取用分布最接近,而3月龄相差较远。(3)不同月龄小鼠脾脏B细胞BCR H-CDR3组库AA长度均是以11-12个AA为主的高斯分布,均高频取用酪氨酸(Y)为代表的疏水性氨基酸,其中天冬酰胺(N)和异亮氨酸(I)随月龄的改变具有统计学差异。(4)不同月龄小鼠脾脏B细胞BCR H-CDR3组库多样性(1/DS)分析显示,随着小鼠月龄的改变组库的多样性出现统计学差异;不同月龄小鼠共同的独特氨基酸数目为46852条;前10条高频克隆扩增氨基酸序列几乎都存在两种高度保守的氨基酸基序“WYFDV”和“YAMDY”。2.3.不同月龄小鼠脾脏记忆B细胞测序及分析结果:(1)不同月龄小鼠脾脏记忆B细胞BCR H-CDR3组库功能性的独特序列/总序列数目:M3S7:91031/1083120;M12S7:135623/725178;M20S7:22758/197852M3S8:12387/46554;M12S8:167897/869812;M20S8:68944/716833M3S9:27825/182002;M12S9:11819/76714;M20S9:6261/56436(2)不同月龄小鼠脾脏记忆B细胞BCR H-CDR3组库都高频取用IGHV14-1、IGHV1-50、IGHV1-14、IGHV1-64、IGHV1-4,对高频取用家族进行统计分析发现IGHV1-4基因具有显著差异;在IGHD基因取用中,IGHD2-3、IGHD3-1、IGHD3-3和IGHD3-2基因取用随小鼠月龄的改变具有统计学差异;对不同月龄小鼠IGHV-IGHJ基因配对取用分析发现,均存在相同的优势配对IGHV1-50-IGHJ1基因;通过聚类分析结果显示,3月龄和12月龄的IGHV-IGHJ基因配对取用分布最接近,而20月龄相差较远。(3)不同月龄小鼠脾脏记忆B细胞BCR H-CDR3组库AA长度均是以11-12个AA为主的高斯分布,均高频取用酪氨酸(Y)为代表的疏水性氨基酸,其中天冬酰胺(N)随月龄的改变出现显著的差异(P<0.05)。(4)不同月龄小鼠脾脏记忆B细胞BCR H-CDR3组库多样性(1/DS)无显著差异;不同月龄小鼠共同的独特氨基酸数目为2474条;前10条高频克隆扩增氨基酸序列都有两种高度保守的氨基酸基序“WSFDV”和“WYFDV”。结论:1.随着小鼠月龄的增加脾脏组织白髓结构变的不规则。2.小鼠脾脏B细胞BCR H-CDR3组库的多样发生增龄性减少;不同月龄小鼠在骨髓和脾脏B细胞、脾脏记忆B细胞BCR H-CDR3组库对IGHV基因家族的取用具有差异性,IGHJ基因取用近似一致。3.随着小鼠月龄的增加氨基酸长度逐渐增加,但氨基酸的取用变化不大且均存在高度保守的氨基酸序列。