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Ⅰ多种分析技术对天花粉的应用研究
本品为葫芦科植物栝楼TrichosantheskirilowiiMaxim.或双边栝楼TrichosanthesrosthorniiHarms的干燥根，甘，苦，微寒，归肺胃经，具有清热泻火，生津止渴，消肿排脓功效，主要用于治疗热病烦渴，肺热燥咳，内热消渴，疮疡肿毒等症。现代药理学研究证明，天花粉能抗病毒、抗肿瘤、提高免疫力、终止妊娠等。
天花粉在我国使用历史悠久，是临床常用中药材之一，全国许多地区有产，以河南、山东为主产区。研究表明，雌雄异株药用植物在生理生化及某些活性成分的含量上有显著的差异。栝楼是雌雄异株植物，雄株的根作为中药天花粉使用，雌株的根也可作为中药天花粉使用，但是，通常以雄株的根为主;雌株的果实、果皮、种子则作为中药瓜蒌、瓜蒌皮、瓜萎子使用。报道显示，在天花粉多糖、天花粉蛋白含量方面，雄株的根中比雌株中的含量高，但尚未见雌、雄来源的天花粉中其他化学成分差异的报道，使用现代分析技术对天花粉进行全面研究的报道也较少，所以我们采集不同产地的雌雄株的天花粉，使用多种分析技术，研究探索雌雄天花粉在成分和物质基础上的差异。中国药典2015版对天花粉药材的质量控制做了性状鉴别、理化鉴别、瓜氨酸薄层色谱、水分、总灰分、二氧化硫残留量、浸出物检查的规定，对天花粉饮片做了炮制、水分、总灰分、二氧化硫残留量、浸出物检查的规定。为确定不同产地和雌雄株天花粉的内在质量，我们对不同产地的雌雄株的天花粉样品进行了金属元素含量的分析、核磁共振氢谱的分析、氨基酸含量的分析、近红外光谱的分析，通过这些不同的技术进行不同产地之间的评判，寻找雌雄株天花粉是否在这些方面的差异，以期为天花粉的质量控制提供更加全面、高效、快捷的方法。
基于电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)技术，首次系统地测定了12种天花粉样品(来自于6个省份，每省各1份雌株和雄株)中Be，Na，Mg，Al，P，K，Ca，V，Cr，Mn,Fe,Co,Ni,Cu,Zn,As,Se,Sr,Mo,Ag,Cd,Sb,Ba,Tl,Pb,Th,U等27种金属元素的含量。(1)进行金属元素的指纹图谱的分析，结果认为这12种样品的大多数金属元素的组成和含量相似，但Al、Zn、Sr的含量差异比较大，Ba、K、Mn有一定的差异。(2)对同一产地的天花粉中27种金属元素的含量取平均值，以该平均值绘制指纹图谱，显示的结果也基本一致，即大多数金属元素的组成和含量相近，但Al、Zn、Sr的含量差异比较大，Ba、K、Mn有一定的差异;Al含量最高的是河北的样品，安徽次之，Sr含量最高的是陕西的样品，安徽次之。(3)所有的雌株天花粉的金属元素含量取平均值，所有的雄株也取平均值，绘制金属元素的指纹图谱，结果认为，雌株天花粉与雄株天花粉的金属元素谱图均有相似的峰形，但是，雌性天花粉金属元素的含量高于雄性的有K、Mn、Cu、Zn、Sr和Ba，其中Sr的差异最大。(4)取野生天花粉和栽培种植的天花粉样品进行金属元素的含量平均值，绘制指纹图谱，可见野生和栽培天花粉中金属元素谱图均有相似峰形，只是含量有所差异，野生天花粉中Sr、Ba的含量高于栽培种植的天花粉，Al、Ca、Mn的含量低于栽培种植的天花粉。(5)利用主成分分析(PCA)和聚类分析(HCA)技术，以12种天花粉样品27种金属元素的含量为变量，进一步描述这12种天花粉样品之间的差异，结果表明，12种天花粉样品聚为4类，聚类分析和主成分分析结果一致，不同产地的天花粉聚在不同的区域，同一产地的雌雄天花粉聚在不同的区域，说明不同产地的天花粉在金属元素含量方面有差异，同一产地的雌雄天花粉在金属元素方面也有差异;PCA分析中得到的载荷分析的结果显示，这种差异性主要体现在Al、K、Fe、Cu、Zn、As、Sr、Ba元素的含量上。
基于核磁共振(NMR)技术，首次系统地测定了6个省共计25种天花粉样品水提物在同一条件下的1H-NMR图谱，并采用SPSS进行了主成分分析，结果表明，各样品之间，1H-NMR图谱有差异，差异明显的特征信号峰有:66.45、6.50、6.55、6.60、6.65、5.85、5.90、7.35、7.40、7.45、7.50、7.55、7.60、7.65、7.70、7.75、7.80、7.85、7.90、7.95、8.00、8.05、8.10、8.15、8.20、8.35、8.40、8.45、8.50、8.55、8.60、8.65、8.70、8.75、8.80、8.85、8.90、8.95、9.00、9.05、9.10、9.15、9.20、9.25、9.30、9.35、9.40ppm(与主成分之间的相关性大于0.9)，61.80、2.35、2.50、2.80、3.15、5.30、5.35、5.40、5.45、5.50、5.55、5.60、5.65、5.75、5.80、5.85、5.90、5.95、6.00、6.05、6.10、6.15、6.20、6.25、6.70、6.75、6.95、7.00、7.05、7.30、7.60、8.25、9.45、9.50、9.55、9.60、9.65、9.70、9.75、9.80、9.85、9.90、9.95ppm(与主成分之间的相关性在0.8～0.9之间)。利用SIMCA软件进行主成分分析和聚类分析，以MestReNova9.0获得的200×20个矩阵为数据，进一步描述这25种天花粉样品之间的差异，结果表明，不同的天花粉聚集在不同的区域。
基于液质联用(LC-MS)技术，首次系统地对12种天花粉样品进行了52种游离氨基酸和水解氨基酸的定性和定量分析。(1)游离氨基酸含量的分析结果表明，必需氨基酸含量为0.0190～0.0854mg·g-1，平均值为0.0509mg·g-1，其中山东平阴(SP)-雄株(M)-1中必需氨基酸的含量最高，为0.0854mg·g-1，河北安国(AG)-M-2中含量最低，为0.0190mg·g-1。必需氨基酸占总氨基酸的比例(EAA/TAA)在14.83～32.75％之间，平均值为24.16％。必需氨基酸与非必需氨基酸的比例(EAA/NEAA)在17.41～48.69％，平均值为32.63％。(2)水解氨基酸含量的分析结果表明，必需氨基酸含量为0.3230～0.4295mg·g-1，平均值为0.3864mg·g-1，其中北京(BJ)-雌株(F)-1中必需氨基酸的含量最高，为0.4295mg·g-1，陕西(SX)-F-2最低，为0.3230mg·g-1。EAA/TAA值在32.84～43.95％之间，平均值为39.33％，EAA/NEAA值在56.05％～67.16％之间，平均值为60.67％。(3)对谷氨酸(Glu)等9种氨基酸进行的分析结果表明，在游离氨基酸方面，这9种氨基酸占TAA的比例为37.72～54.50％，AG-M-2的含量分数最高，占TAA的比例为54.50％，含量分数最低的是安徽肥西(AF)-F-2，占TAA的比例为37.72％;在水解氨基酸方面，这9种氨基酸占TAA的比例为60.60～66.91％，SX-F-2的比例最高，为66.91％，江苏金湖(JJ)-M-1的比例最低，为60.60％。(4)对这些天花粉中游离氨基酸和水解氨基酸进行的主成分分析和聚类分析，结果表明，12种天花粉均可以聚为4类。(5)指纹图谱的分析结果显示，各样品中的游离氨基酸和水解氨基酸的组成和含量均具有一定的规律性，不同产地、不同性别的不同天花粉样品中，各氨基酸的指纹图谱具有较强的特征性与一致性。
基于近红外光谱(NIR)技术，首次建立快速鉴别不同产地天花粉的定性模型。测定了38种天花粉样品的原始NIR图谱(3500～10500cm-1)，经多元散射校正(MSC)、一阶导数、二阶导数，并结合光谱平滑处理，选择4038.21～10861.12cm-1作为近红外光谱分析的波数范围，最终确定采用一阶导数+Savitzky-Golayfilter预处理后进行PCA分析，显示结果认为，样品在PCA分析图中的分布广泛，各地之间的分布不明显，不同产地的天花粉不能达到完全分开，说明不同产地的天花粉差异不大。
通过上述多方面、多角度的分析，我们认为，不同产地的天花粉样品之间的差异不大，雌株与雄株之间也未见显著的差异，说明各地的天花粉的质量是稳定的，具有一定程度上的一致性，为天花粉全面的质量控制提供了科学依据。
Ⅱ辅酶Q10标准样品的研制
辅酶Q10，是一种脂溶性醌，在一些食物中含量比较高，如动物脏器、花生、豆油、沙丁鱼、牛肉、鲭鱼等，在一些植物中也有分布，如烟叶、构树等。研究发现辅酶Q10有抗肿瘤、免疫调节、抗衰老、抗氧化、治疗心血管系统疾病、保护心脏、预防和治疗慢性疲劳综合症等作用。可以作为他汀类的辅助药物，也可以作保健品及食品添加剂使用。辅酶Q10尚未见国家标准样品的研制，为此，我们成功申请了国家标准样品的研制计划，参照ISOGuide35:2006，按照GB/T15000-2008标准样品系列工作导则，研制辅酶Q10标准样品，将其作为标准样品用于药用植物、药品和保健品的定性和定量分析评价。辅酶Q10标准样品是属于实物标准，与药典等文字标准是一种不同的概念，对应的是国家标准化管理委员会。
本研究以茄科植物烟叶(Nicotiana tabacum L.)的新鲜叶为材料，经过85％乙醇超声提取，减压回收溶剂，以水悬浮，用石油醚进行多次萃取后得到的提取物，分离采用硅胶柱层色谱技术，精制和纯化使用制备高效液相色谱，进行真空干燥，获得橙黄色的辅酶Q10样品，分装为200瓶，每瓶10mg。编号后置于0～8℃恒温冰箱中密封保存。采用高效液相色谱法测定纯度，采用峰面积归一化法计算纯度值。
依据ISOGuide35:2006/GB/T15000-2008标准样品工作导则(3)《标准样品定值的一般原则和统计方法》第7章均匀性研究的要求对辅酶Q10标准样品进行均匀性检验，采用F检验确定均匀性数据是否符合正态分布。辅酶Q10标准样品的F检验值小于F临界值，说明该样品是均匀的。
采用长期稳定性试验和溶液稳定性试验来考察辅酶Q10标准样品的稳定性。辅酶Q10标准样品以棕色玻璃小瓶和锡箔纸密封包装，放置于0～8℃的冰箱条件下。长期稳定性试验:分别在样品完成包装后放置的第0，1，2，3，6，12和18个月时取3瓶辅酶Q10标准样品，测定纯度，根据GB/T15000-2008标准样品工作导则(3)《标准样品定值的一般原则和统计方法》的要求，我们以直线模型作为经验模型，采用t检验和F检验对长期稳定性试验获得的数据进行分析。斜率是不显著的，未观测到不稳定性。方差分析的F值小于F临界值，可以认为该标准样品至少在18个月内是稳定的。溶液稳定性试验:称取样品2mg，加无水乙醇超声10min溶解，并定容至10mL棕色容量瓶中，过0.45μm滤膜，即得0.2mg·mL-1的样品溶液，分别测定第0，2，4，6，8，12，24h的纯度，根据测定结果，辅酶Q10标准样品在无水乙醇溶液中24h内是稳定的。因此，我们将辅酶Q10标准样品的有效期定为18个月，无水乙醇溶液中的稳定性定为24h。
标准样品定值的方法根据GB/T15000-2008《标准样品工作导则(3)标准样品定值的一般原则和统计方法》规定，定值需由多个权威实验室独立进行分析，我们选择了8家实验室进行联合定值，采用HPLC联合二极管阵列检测器测量纯度。用格拉布斯法(Grubbs)检验组内的数据的异常值，结果显示8家实验室的数据没有异常值。根据GB/T15000.3-2008标准规定，定值结果由标准值和不确定度组成。标准样品特性标准值的测量不确定度UCRM由测定得到的标准值的不确定度uchar、均匀性检验的不确定度ubb和稳定性检验的不确定度ults组成。辅酶Q10标准样品的纯度为100.00％，扩展不确定度为0.00％。
本品为葫芦科植物栝楼TrichosantheskirilowiiMaxim.或双边栝楼TrichosanthesrosthorniiHarms的干燥根，甘，苦，微寒，归肺胃经，具有清热泻火，生津止渴，消肿排脓功效，主要用于治疗热病烦渴，肺热燥咳，内热消渴，疮疡肿毒等症。现代药理学研究证明，天花粉能抗病毒、抗肿瘤、提高免疫力、终止妊娠等。
天花粉在我国使用历史悠久，是临床常用中药材之一，全国许多地区有产，以河南、山东为主产区。研究表明，雌雄异株药用植物在生理生化及某些活性成分的含量上有显著的差异。栝楼是雌雄异株植物，雄株的根作为中药天花粉使用，雌株的根也可作为中药天花粉使用，但是，通常以雄株的根为主;雌株的果实、果皮、种子则作为中药瓜蒌、瓜蒌皮、瓜萎子使用。报道显示，在天花粉多糖、天花粉蛋白含量方面，雄株的根中比雌株中的含量高，但尚未见雌、雄来源的天花粉中其他化学成分差异的报道，使用现代分析技术对天花粉进行全面研究的报道也较少，所以我们采集不同产地的雌雄株的天花粉，使用多种分析技术，研究探索雌雄天花粉在成分和物质基础上的差异。中国药典2015版对天花粉药材的质量控制做了性状鉴别、理化鉴别、瓜氨酸薄层色谱、水分、总灰分、二氧化硫残留量、浸出物检查的规定，对天花粉饮片做了炮制、水分、总灰分、二氧化硫残留量、浸出物检查的规定。为确定不同产地和雌雄株天花粉的内在质量，我们对不同产地的雌雄株的天花粉样品进行了金属元素含量的分析、核磁共振氢谱的分析、氨基酸含量的分析、近红外光谱的分析，通过这些不同的技术进行不同产地之间的评判，寻找雌雄株天花粉是否在这些方面的差异，以期为天花粉的质量控制提供更加全面、高效、快捷的方法。
基于电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)技术，首次系统地测定了12种天花粉样品(来自于6个省份，每省各1份雌株和雄株)中Be，Na，Mg，Al，P，K，Ca，V，Cr，Mn,Fe,Co,Ni,Cu,Zn,As,Se,Sr,Mo,Ag,Cd,Sb,Ba,Tl,Pb,Th,U等27种金属元素的含量。(1)进行金属元素的指纹图谱的分析，结果认为这12种样品的大多数金属元素的组成和含量相似，但Al、Zn、Sr的含量差异比较大，Ba、K、Mn有一定的差异。(2)对同一产地的天花粉中27种金属元素的含量取平均值，以该平均值绘制指纹图谱，显示的结果也基本一致，即大多数金属元素的组成和含量相近，但Al、Zn、Sr的含量差异比较大，Ba、K、Mn有一定的差异;Al含量最高的是河北的样品，安徽次之，Sr含量最高的是陕西的样品，安徽次之。(3)所有的雌株天花粉的金属元素含量取平均值，所有的雄株也取平均值，绘制金属元素的指纹图谱，结果认为，雌株天花粉与雄株天花粉的金属元素谱图均有相似的峰形，但是，雌性天花粉金属元素的含量高于雄性的有K、Mn、Cu、Zn、Sr和Ba，其中Sr的差异最大。(4)取野生天花粉和栽培种植的天花粉样品进行金属元素的含量平均值，绘制指纹图谱，可见野生和栽培天花粉中金属元素谱图均有相似峰形，只是含量有所差异，野生天花粉中Sr、Ba的含量高于栽培种植的天花粉，Al、Ca、Mn的含量低于栽培种植的天花粉。(5)利用主成分分析(PCA)和聚类分析(HCA)技术，以12种天花粉样品27种金属元素的含量为变量，进一步描述这12种天花粉样品之间的差异，结果表明，12种天花粉样品聚为4类，聚类分析和主成分分析结果一致，不同产地的天花粉聚在不同的区域，同一产地的雌雄天花粉聚在不同的区域，说明不同产地的天花粉在金属元素含量方面有差异，同一产地的雌雄天花粉在金属元素方面也有差异;PCA分析中得到的载荷分析的结果显示，这种差异性主要体现在Al、K、Fe、Cu、Zn、As、Sr、Ba元素的含量上。
基于核磁共振(NMR)技术，首次系统地测定了6个省共计25种天花粉样品水提物在同一条件下的1H-NMR图谱，并采用SPSS进行了主成分分析，结果表明，各样品之间，1H-NMR图谱有差异，差异明显的特征信号峰有:66.45、6.50、6.55、6.60、6.65、5.85、5.90、7.35、7.40、7.45、7.50、7.55、7.60、7.65、7.70、7.75、7.80、7.85、7.90、7.95、8.00、8.05、8.10、8.15、8.20、8.35、8.40、8.45、8.50、8.55、8.60、8.65、8.70、8.75、8.80、8.85、8.90、8.95、9.00、9.05、9.10、9.15、9.20、9.25、9.30、9.35、9.40ppm(与主成分之间的相关性大于0.9)，61.80、2.35、2.50、2.80、3.15、5.30、5.35、5.40、5.45、5.50、5.55、5.60、5.65、5.75、5.80、5.85、5.90、5.95、6.00、6.05、6.10、6.15、6.20、6.25、6.70、6.75、6.95、7.00、7.05、7.30、7.60、8.25、9.45、9.50、9.55、9.60、9.65、9.70、9.75、9.80、9.85、9.90、9.95ppm(与主成分之间的相关性在0.8～0.9之间)。利用SIMCA软件进行主成分分析和聚类分析，以MestReNova9.0获得的200×20个矩阵为数据，进一步描述这25种天花粉样品之间的差异，结果表明，不同的天花粉聚集在不同的区域。
基于液质联用(LC-MS)技术，首次系统地对12种天花粉样品进行了52种游离氨基酸和水解氨基酸的定性和定量分析。(1)游离氨基酸含量的分析结果表明，必需氨基酸含量为0.0190～0.0854mg·g-1，平均值为0.0509mg·g-1，其中山东平阴(SP)-雄株(M)-1中必需氨基酸的含量最高，为0.0854mg·g-1，河北安国(AG)-M-2中含量最低，为0.0190mg·g-1。必需氨基酸占总氨基酸的比例(EAA/TAA)在14.83～32.75％之间，平均值为24.16％。必需氨基酸与非必需氨基酸的比例(EAA/NEAA)在17.41～48.69％，平均值为32.63％。(2)水解氨基酸含量的分析结果表明，必需氨基酸含量为0.3230～0.4295mg·g-1，平均值为0.3864mg·g-1，其中北京(BJ)-雌株(F)-1中必需氨基酸的含量最高，为0.4295mg·g-1，陕西(SX)-F-2最低，为0.3230mg·g-1。EAA/TAA值在32.84～43.95％之间，平均值为39.33％，EAA/NEAA值在56.05％～67.16％之间，平均值为60.67％。(3)对谷氨酸(Glu)等9种氨基酸进行的分析结果表明，在游离氨基酸方面，这9种氨基酸占TAA的比例为37.72～54.50％，AG-M-2的含量分数最高，占TAA的比例为54.50％，含量分数最低的是安徽肥西(AF)-F-2，占TAA的比例为37.72％;在水解氨基酸方面，这9种氨基酸占TAA的比例为60.60～66.91％，SX-F-2的比例最高，为66.91％，江苏金湖(JJ)-M-1的比例最低，为60.60％。(4)对这些天花粉中游离氨基酸和水解氨基酸进行的主成分分析和聚类分析，结果表明，12种天花粉均可以聚为4类。(5)指纹图谱的分析结果显示，各样品中的游离氨基酸和水解氨基酸的组成和含量均具有一定的规律性，不同产地、不同性别的不同天花粉样品中，各氨基酸的指纹图谱具有较强的特征性与一致性。
基于近红外光谱(NIR)技术，首次建立快速鉴别不同产地天花粉的定性模型。测定了38种天花粉样品的原始NIR图谱(3500～10500cm-1)，经多元散射校正(MSC)、一阶导数、二阶导数，并结合光谱平滑处理，选择4038.21～10861.12cm-1作为近红外光谱分析的波数范围，最终确定采用一阶导数+Savitzky-Golayfilter预处理后进行PCA分析，显示结果认为，样品在PCA分析图中的分布广泛，各地之间的分布不明显，不同产地的天花粉不能达到完全分开，说明不同产地的天花粉差异不大。
通过上述多方面、多角度的分析，我们认为，不同产地的天花粉样品之间的差异不大，雌株与雄株之间也未见显著的差异，说明各地的天花粉的质量是稳定的，具有一定程度上的一致性，为天花粉全面的质量控制提供了科学依据。
Ⅱ辅酶Q10标准样品的研制
辅酶Q10，是一种脂溶性醌，在一些食物中含量比较高，如动物脏器、花生、豆油、沙丁鱼、牛肉、鲭鱼等，在一些植物中也有分布，如烟叶、构树等。研究发现辅酶Q10有抗肿瘤、免疫调节、抗衰老、抗氧化、治疗心血管系统疾病、保护心脏、预防和治疗慢性疲劳综合症等作用。可以作为他汀类的辅助药物，也可以作保健品及食品添加剂使用。辅酶Q10尚未见国家标准样品的研制，为此，我们成功申请了国家标准样品的研制计划，参照ISOGuide35:2006，按照GB/T15000-2008标准样品系列工作导则，研制辅酶Q10标准样品，将其作为标准样品用于药用植物、药品和保健品的定性和定量分析评价。辅酶Q10标准样品是属于实物标准，与药典等文字标准是一种不同的概念，对应的是国家标准化管理委员会。
本研究以茄科植物烟叶(Nicotiana tabacum L.)的新鲜叶为材料，经过85％乙醇超声提取，减压回收溶剂，以水悬浮，用石油醚进行多次萃取后得到的提取物，分离采用硅胶柱层色谱技术，精制和纯化使用制备高效液相色谱，进行真空干燥，获得橙黄色的辅酶Q10样品，分装为200瓶，每瓶10mg。编号后置于0～8℃恒温冰箱中密封保存。采用高效液相色谱法测定纯度，采用峰面积归一化法计算纯度值。
依据ISOGuide35:2006/GB/T15000-2008标准样品工作导则(3)《标准样品定值的一般原则和统计方法》第7章均匀性研究的要求对辅酶Q10标准样品进行均匀性检验，采用F检验确定均匀性数据是否符合正态分布。辅酶Q10标准样品的F检验值小于F临界值，说明该样品是均匀的。
采用长期稳定性试验和溶液稳定性试验来考察辅酶Q10标准样品的稳定性。辅酶Q10标准样品以棕色玻璃小瓶和锡箔纸密封包装，放置于0～8℃的冰箱条件下。长期稳定性试验:分别在样品完成包装后放置的第0，1，2，3，6，12和18个月时取3瓶辅酶Q10标准样品，测定纯度，根据GB/T15000-2008标准样品工作导则(3)《标准样品定值的一般原则和统计方法》的要求，我们以直线模型作为经验模型，采用t检验和F检验对长期稳定性试验获得的数据进行分析。斜率是不显著的，未观测到不稳定性。方差分析的F值小于F临界值，可以认为该标准样品至少在18个月内是稳定的。溶液稳定性试验:称取样品2mg，加无水乙醇超声10min溶解，并定容至10mL棕色容量瓶中，过0.45μm滤膜，即得0.2mg·mL-1的样品溶液，分别测定第0，2，4，6，8，12，24h的纯度，根据测定结果，辅酶Q10标准样品在无水乙醇溶液中24h内是稳定的。因此，我们将辅酶Q10标准样品的有效期定为18个月，无水乙醇溶液中的稳定性定为24h。
标准样品定值的方法根据GB/T15000-2008《标准样品工作导则(3)标准样品定值的一般原则和统计方法》规定，定值需由多个权威实验室独立进行分析，我们选择了8家实验室进行联合定值，采用HPLC联合二极管阵列检测器测量纯度。用格拉布斯法(Grubbs)检验组内的数据的异常值，结果显示8家实验室的数据没有异常值。根据GB/T15000.3-2008标准规定，定值结果由标准值和不确定度组成。标准样品特性标准值的测量不确定度UCRM由测定得到的标准值的不确定度uchar、均匀性检验的不确定度ubb和稳定性检验的不确定度ults组成。辅酶Q10标准样品的纯度为100.00％，扩展不确定度为0.00％。