近年来,随着全球老龄化趋势加剧、人口的剧增、社会生活环境的改变等因素使得全球癌症的发病率和死亡率呈快速上升的趋势,全球癌症负担进一步加重。据2018年全球癌症流行病学统计数据显示,2018年全球癌症新发病例高达1810万,死亡病例高达960万。因此,对癌症的早诊、早治和综合干预已成为现阶段全球在癌症防控领域的重要任务。传统的癌症治疗手段,如化疗和放疗等存在副作用大、无法有效控制晚期恶性肿瘤的进展和不能有效改善难治性和广泛转移性癌症患者的生存期和生活质量等问题,因而无法从根本上控制癌症进展。肿瘤分子靶向治疗在肺癌、白血病和黑色素瘤等适应症的部分患者上取得了较大的成功,但分子靶向治疗药物仅对特定基因突变的肿瘤发挥作用而使得获益人群受限,且易产生耐药等问题,导致长期治疗效果不理想,同时由于副作用较大而限制了其临床应用。以 PD-1/PD-L1（Programmed Death 1/Programmed Death-Ligand 1）抑制剂疗法为代表的癌症免疫疗法因其具有良好的安全性和显著的肿瘤治疗效果,已成为当前肿瘤治疗领域最有希望攻克癌症的治疗方式。与传统的癌症治疗手段相比,癌症免疫疗法最突出的优势是疗效较持久,但其疗效受肿瘤微环境中PD-L1表达水平、肿瘤突变负荷、免疫细胞浸润水平、微卫星不稳定性的高低等多重因素影响,导致其对所有肿瘤的客观应答率仅为20%-30%,仍有大部分的肿瘤患者无法从免疫治疗中获益。因此,仍亟需开发新型高效的治疗手段使更多的肿瘤患者能获益。溶瘤病毒疗法是一种利用具有天然溶瘤活性的或经基因工程修饰的病毒选择性地在肿瘤细胞中高效复制并快速裂解肿瘤细胞,且释放的肿瘤相关抗原和损伤相关分子模式等“原位肿瘤疫苗”可有效的启动并活化抗肿瘤疫应答的新型肿瘤免疫治疗的方法。溶瘤病毒疗法相较于其他的肿瘤治疗方法,具有肿瘤选择性复制与杀伤、安全高效、广谱抗肿瘤活性和免疫调节等突出优势,现已成为极具前景的一类肿瘤免疫疗法。临床前基础研究和临床研究结果均表明通过溶瘤病毒局部注射可增加肿瘤组织中免疫细胞的浸润,将“冷”肿瘤转变为“热肿瘤”,协同增加PD-1/PD-L1抑制剂的抗肿瘤疗效。基于溶瘤病毒ImLygic TM的良好抗肿瘤特性,2015年美国FDA首次批准溶瘤病毒药物ImLygicTM（T-VEC）用于局部治疗首次手术切除后复发的恶性黑色素瘤。2018年《新英格兰医学》杂志发表了美国杜克大学开发的脊髓灰质炎溶瘤病毒PVSRIPO在复发性胶质瘤适应症上的I期临床试验结果显示,PVSRIPO治疗晚期胶质母细胞瘤患者的3年存活率为标准治疗的5倍（21%vs.4%）。围绕溶瘤病毒的药物开发和多药联合治疗是目前肿瘤免疫疗法领域内十分具有前景的研究方向之一。本研究是在野生型人I型单纯疱疹病毒（Herpes Simplex Virus type I,HSV-1）KOS株的基础上通过分子遗传学改造而获得的具有肿瘤靶向性的溶瘤病毒OVH,并系统性的完成溶瘤病毒OVH的实验室安全性和药效学研究,并对其治疗机制进行了初步探索。本研究的第一部分旨在理性设计和重组筛选肿瘤靶向性新型溶瘤病毒OVH,并在多种细胞模型上评估OVH的肿瘤选择性和在多种小鼠模型上分别评估OVH的神经毒性和急性毒性。利用同源重组技术在KOS毒株基础上删除病毒主要神经毒力基因γ34.5（编码ICP34.5蛋白）和主要参与激活病毒β和γ基因表达,平衡病毒的潜伏性感染和裂解性感染及诱导病毒免疫逃逸的基因RL2（编码ICP0蛋白）,同时用hTERT启动子调控编码病毒立即早期蛋白ICP27的UL54基因表达,通过差异筛选最终获得具有极低的神经毒性和良好的肿瘤选择性的重组病毒OVH。体内外安全性评价结果均表明OVH相较于野生型病毒KOS、ICP0缺陷病毒dICP0、ICP0和ICP34.5双缺陷病毒OVN具有较好的肿瘤细胞选择性复制与杀伤的特性、显著降低的神经毒性和急性毒性。以上结果提示OVH具有进一步开发为溶瘤病毒药物的潜力,为探索应用低毒高效的溶瘤病毒治疗肿瘤奠定了基础。本研究的第二部分主要为溶瘤病毒OVH体内和体外溶瘤活性评估及机制研究,旨在明确溶瘤病毒OVH的体外溶瘤活性及探明其作用机制。本研究首先在53株人源肿瘤细胞上评估了 OVH的杀伤效果,其中40株肿瘤细胞对OVH超级敏感（将感染复数MOI（MultiplicityofInfection）=1时,OVH对肿瘤细胞的杀伤率超过50%定义为超级敏感型细胞,Hyper-sensitive（HS））,8株细胞株为敏感性细胞株(将感染复数MOI=1时,OVH对肿瘤细胞的杀伤率超过20%但小于50%,定义为敏感型细胞,Sensitive（S）,5株肿瘤细胞株为抵制型细胞株（将感染复数MOI=1时,OVH对肿瘤细胞的杀伤率小于20%,定义为抵制型细胞,Refractory（R））。此外,我们从临床手术切除的肿瘤标本中分离培养获得原代肝癌细胞、原代胶质瘤细胞和原代卵巢癌细胞。三株原代肿瘤细胞均为对OVH超级敏感型细胞。以上体外肿瘤细胞杀伤实验结果表明,OVH具有广谱的体外抗肿瘤活性。我们研究发现OVH感染肿瘤细胞后会诱导细胞凋亡并引起免疫原性细胞死亡（ATP和HMGB1胞外释放增加、钙网蛋白膜转位等）,提示OVH通过裂解肿瘤细胞可能会产生“原位肿瘤疫苗”,从而诱导系统性的抗肿瘤免疫应答。体内药效学结果显示,OVH瘤内注射治疗能显著抑制免疫缺陷鼠上7种人源肿瘤细胞移植瘤的生长和免疫健全小鼠上3种鼠源肿瘤细胞移植瘤的生长。在免疫系统健全的小鼠皮下移植瘤治疗模型中,OVH单侧治疗可以显著抑制甚至大部分的清除治疗侧和远端侧的肿瘤。以上体内药效学研究结果表明,溶瘤病毒OVH具有显著的体内溶瘤活性,且瘤内注射OVH能诱导全身性的抗肿瘤免疫反应抑制治疗侧和远端侧肿瘤的生长。我们进一步的研究发现,经OVH治愈的荷瘤小鼠未出现肿瘤复发,并可以有效防止相同肿瘤细胞的二次攻击。蛋白免疫印迹分析显示经OVH治愈的荷瘤小鼠的多抗血清与相同肿瘤细胞来源的细胞裂解液之间存在特异性反应,将这部分血清回输到接种了相同肿瘤细胞的荷瘤鼠上发现多抗血清具有良好的抑瘤效果,而特异性去除多抗的血清则没有治疗效果。上述结果显示,经过OVH治愈的小鼠体内产生了肿瘤特异性抗体。通过对治疗侧和远端侧肿瘤组织中的免疫细胞亚群分析发现,OVH的治疗可显著增加治疗侧和远端侧肿瘤组织中免疫细胞的浸润,包括上调和活化肿瘤组织中的CD8+T细胞,下调调节性T细胞的浸润水平等。体内抗体急性阻断免疫细胞的实验结果显示,OVH治疗的疗效主要依赖于CD8+T细胞介导的抗肿瘤免疫,B细胞、NK细胞和巨噬细胞等其他免疫细胞发挥了一定的抗肿瘤作用。联合PD-1抗体能进一步的提高溶瘤病毒OVH的抗肿瘤疗效,且该联合治疗的疗效也是主要依赖于CD8+T细胞介导的抗肿瘤免疫。综上所述,本研究设计的溶瘤病毒OVH为γ34.5和RL2双基因缺失,同时用hTERT启动子调控编码病毒立即早期蛋白ICP27的UL54基因表达,具有良好的肿瘤选择性和安全性的溶瘤病毒。OVH体外对肿瘤细胞具有广谱的溶瘤活性,在多种小鼠肿瘤模型中均可显著抑制甚至清除小鼠治疗侧和远端侧皮下肿瘤。瘤内注射溶瘤病毒OVH治疗可重编程肿瘤免疫微环境,激活机体的抗肿瘤体液免疫应答和细胞免疫应答,宿主抗肿瘤免疫应答与溶瘤病毒介导的直接抗肿瘤作用相互协同,最终达到溶瘤治疗和免疫治疗叠加的双重抗肿瘤效果。更重要的是,我们发现联合PD-1抗体治疗能进一步的提高溶瘤病毒OVH的抗肿瘤效果。本研究开发的肿瘤靶向性新型溶瘤病毒OVH具有安全性、高效、广谱的抗肿瘤活性,为开发可用于恶性肿瘤治疗的溶瘤病毒创新药物奠定了基础。