造成人体关节软骨损伤的原因主要为创伤和关节炎，关节软骨全层损伤可由于骨髓中间充质干细胞的高速增殖修复，但这种修复由于缺乏相应的刺激机制，只能形成纤维软骨，而不能形成符合关节生理、力学要求的透明软骨；单纯软骨部分损伤软骨组织内无血管，软骨细胞迁移迟缓，无法使损伤区域软骨细胞再生，因此，关节炎及关节创伤后的软骨修复不能依赖于软骨细胞的增殖和迁移。多年来，人们一直试图修复或重建软骨组织，随着软骨细胞培养技术的成熟及医学生物材料学的飞速发展，组织工程技术在软骨修复中显现出无与伦比的优势。软骨组织工程的核心技术就是利用合适的种子细胞复合生物材料，在体内或体外构建与人关节透明软骨形态、结构、性能相似的软骨样组织，用于软骨移植。主要涉及两个方面的物质基础：1)适宜的种子细胞。2)可降解、具有生物活性、适宜于种子细胞生长的载体。 自体或同种异体软骨细胞是软骨组织工程较理想的种子细胞，但其取材困难、创伤大、来源有限，加之软骨细胞为成熟的终末细胞，增殖过程中容易丧失软骨表型，不能满足软骨组织工程对种子细胞的大量需求。自体骨髓基质干细胞(MSC)来源丰富，取材容易，具有旺盛的增殖能力及向成软骨细胞分化的潜能，已成为软骨组织工程的首选种子细胞，但MSC诱导分化为成软骨细胞且应用于软骨组织工程的技术尚不十分完善，目前主要采用的技术为细胞团块离心管培养，其构建的软骨组织在力学性能上很难达到关节软骨的要求。软骨组织工程的材料学研究主要体现在两类基质材料方面的进展，一类为天然基质材料，如胶原、壳聚糖、纤维素等；一类为人工合成可降解材料，如PGA、PLA等，但两者在来源、塑形能力及细胞识别信号等方面存在不足。本研究从骨髓基质干细胞的成软骨诱导、体外培养及以多孔复合材料作为细胞载体等方面着手，探讨诱导MSC向成软骨方向分化的理想条件、体外培养成软骨细胞维持表型的作用机制及细胞与多孔复合材料之间的相互作用，从两个方面完成：一）骨髓基质干细胞的原代分离、培养、成软骨诱导及鉴定；二）经成软骨诱导的MSC细胞在三维多孔材料PDLLA、PDLLA／壳聚糖复合体上培养的状况及鉴定。目的在于：＊）通过骨髓基质干细胞的原代分离、培养及成软骨诱导，观察原代细胞扩增能力及其向成软骨方向分化的潜能；（）寻求骨髓基质干细胞向成软骨方向分化的理想诱导条件；u）观察经成软骨诱导的财C在PDLLA、PDLLA／壳聚糖多孔载体上三维的增殖状况，探求细胞与材料间的相互作用；门）观察经成软骨诱导的 MSC在体外三维培养系统中细胞因子的释放状况，了解维持诱导细胞软骨表型的合适条件及作用机制。第一部分 人骨髓基质干细胞的原代分离、体外培养、成软骨诱导及 鉴定 目的：了解骨髓基质干细胞原代培养的特性及增殖能力，探讨轻度离心和化学限定培养基法诱导骨髓基质干细胞向成软骨方向分化的作用；为软骨组织工程提供足量、合适的种子细胞。 方法：取健康成人略后上棘处骨髓 5ml，经 percoll液分离后密度梯度离心，10‘砌l密度接种培养，观察原代细胞的贴壁、增殖状况，细胞长满瓶底后进行传代培养；传至第三代细胞，重新消化后以500转／分钟轻度离心 5分钟，10V加 l接种，改用化学限定培养基代替完全培养基培养，倒置显微镜观察细胞生长情况及形态变化，甲苯胺蓝染色观察诱导细胞合成细胞外基质QCM）中的蛋白多糖，免疫细胞化学染色检测ECM中＊胶原的蛋白合成，RT干CR鉴定诱导细胞＊胶原mRNA的表达。 结果：原代骨髓基质干细胞易于体外培养，增殖旺盛；经轻度离心和化学限定培养基诱导后细胞呈高密度生长，仍保持较旺盛的增殖能力，细胞转化成圆形肥大细胞，甲苯胺蓝染色显示软骨细胞外基质 v的特异性异染，11胶原蛋白免疫细胞化学染色呈强阳性，BT干CR鉴定显示＊胶原mRNA丰富的表达。诱导后传一代细胞仍能保持成软骨细胞的上述表型，传三代细胞则基本丧失成软骨细胞的上述表型。 结论：经percoll液密度梯度离心法能获得纯度较高的人骨髓间充质干细胞，这种细胞在体外培养体系中保持旺盛的增殖能力；经轻度离心和化学限定培养基法可诱导骨髓间充质干细胞向成软骨方向分化，增殖旺盛，可传一代培养，是软骨组织工程理想的种子细胞。