软腐病是粮食作物（马铃薯）和经济作物（蔬菜和花卉）的重要病害,全世界每年因发生该病害而导致经济损失高达数十亿美元。引起软腐病的病原菌主要属于果胶杆菌属（Pactobacterium）和迪克氏菌属（Dickeya）,这类病原菌分布范围广、寄主多样。其中,果胶杆菌巴西亚种（P.carotovorum subsp.brasilience）为本实验室2018年从内蒙古马铃薯腐烂组织分离鉴定获得,该病原菌在多个国家和地区发生,引起马铃薯黑胫和茎部腐烂,给马铃薯生产造成了巨大的经济损失。本实验室前期研究发现小RNA伴侣蛋白Hfq对胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种（P.carotovorum subsp.carotovorum）PccS1菌株的致病力具有全局性调控功能,且研究结果表明hexA是果胶杆菌小RNA（ArcZ）的潜在靶标基因之一,ArcZ负调控hexA。众所周知,非编码小RNA通过碱基配对与靶标基因mRNA结合,在转录后水平对基因表达进行调控。开展果胶杆菌非编码小RNA在致病过程中的调控机制研究,对果胶杆菌防控对策研究具有重要意义。为了探究P.carotovorum subsp.brasilience（Pcb）中ArcZ的致病调控功能,本研究通过同源重组构建了hfq和arcZ单个或多个核苷酸序列缺失突变菌株。致病性测定结果表明Δhfq与ΔarcZ/hfq致病能力几乎完全丧失,ΔarcZ致病能力也显著下降。胞外酶活性检测结果表明这些突变菌株的三种胞外酶活性均显著降低。此外,这些突变菌株接种寄主植物马铃薯（SolanumtuberosumL）,与接种野生型菌株相比,马铃薯叶片中胼胝质沉积显著增多,表明ArcZ对Pcb致病力具有重要调控功能。细菌小RNA主要是通过与靶标基因mRNA的非翻译区（5’-UTR）或编码区碱基配对实现对靶标基因的调控功能。为准确验证ArcZ靶标基因hexA及其sRNA-mRNA结合位点,探究ArcZ致病机理,本研究通过双交换同源重组构建了hexA核苷酸序列缺失突变菌株和过表达菌株,致病性测定表明hexA显著负调控PccS1的致病力。接着本研究在hexA5’-UTR进行核苷酸序列片段敲除,通过双交换同源重组和回补融合获得阿拉伯糖诱导表达菌株ΔarcZ/hexA-500～-124-hexA-FLAG（T1-PBAD-arcZ）。Western blot分析结果表明hexA 5’-UTR的-500～-124序列内存在与ArcZ的结合位点。在软件预测初步确定ArcZ与hexA 5’-UTR的-500～-124序列中潜在结合位点的基础上,构建了两个ArcZ点突变,并通过双交换同源重组和回补融合获得阿拉伯糖诱导表达菌株 ΔarcZ-hexA-FLAG（T1-PBAD-arcZ*1）和 ΔarcZ-hexA-FLAG（T1-PBAD-arcZ*2）。Western blot分析表明hexA 5’-UTR中的-293和-330位点是与ArcZ结合的位点,并且这两个位点均具有GC区域。为此,我们初步获得ArcZ与靶标基因hexA联合调控果胶杆菌致病性的模型:ArcZ负调控靶标基因hexA,该靶标基因抑制胞外酶活性,负调控致病力。寄主植物在遭受病原菌侵染时,会产生系统性免疫反应,分析病原菌侵染过程中寄主免疫反应变化,有助于加深理解ArcZ致病调控机理。为了探究果胶杆菌侵染过程中马铃薯的响应机制,我们利用Pcb野生型、ΔarcZ、Δhfq和ΔarcZ/hfq分别接种无菌培养马铃薯（DM1-3）植株,在出现明显症状前,提取马铃薯RNA样品,进行RNA-seq,利用各类数据库和生物信息学分析软件对差异表达基因进行功能富集分析。结果表明,马铃薯在细胞壁,质外体,细胞外区域,叶绿体等多种细胞组分中,通过调控乙烯激活的信号通路,苯丙烷、碳、氨基酸等代谢以及多种次生代谢产物的合成产生响应。另外,ArcZ抑制了马铃薯胁迫响应中的光合作用相关途径,包括光合系统Ⅱ（PSII）光能捕获和卡尔文循环各种重要酶的合成等;ArcZ在Hfq协同作用下,抑制了马铃薯植株中富含亮氨酸重复类受体蛋白激酶（LRR RLKs）基因的表达。胼胝质沉积是植物病原菌相关分子模式诱导抗性（Pathogen associated molecular pattern trigged immunity,PTI）表型之一,ArcZ和/或hfq突变,上述马铃薯基因的差异表达,导致胼胝质沉积增加,从寄主响应角度,证实了 ArcZ对果胶杆菌致病力的调控功能。综上所述,果胶杆菌小RNA（ArcZ）与hexA 5’-UTR两个位点结合,负调控该靶标基因,显著影响马铃薯防御响应,对果胶杆菌Pcb致病力具有关键调控作用。